Summary

Produção recombinante Retroviral e infecção de células B

Published: February 18, 2011
doi:

Summary

Um sistema eficiente de estrutura e análise da função de um gene em um<em> Ex vivo</em> Cultura de linfócitos B do baço é descrito. Este método tira proveito da produção recombinante retroviral em uma linhagem de células helper livre, ecotrophic embalagem. Estável, hereditárias expressão de um gene de interesse dentro linfócitos primário é alcançado levando a geração de anticorpos de superfície de células B sofrer recombinação mudança de classe.

Abstract

A expressão de genes transgênicos em células eucarióticas é uma abordagem inversa poderosa genética em que um gene de interesse é expressa sob o controle de um sistema de expressão heteróloga para facilitar a análise do fenótipo resultante. Esta abordagem pode ser usada para expressar um gene que não é normalmente encontrado no organismo, para expressar uma forma mutante do gene de um produto, ou sobre-expressar uma forma dominante negativo do produto do gene. É particularmente útil no estudo do sistema hematopoético, onde a regulação da transcrição é um mecanismo de controle importante no desenvolvimento e diferenciação das células B 1, revisto em 2-4.

Rato genética é uma ferramenta poderosa para o estudo dos genes humanos e doenças. Uma análise comparativa do mouse e do genoma humano revela conservação da sintenia em mais de 90% do genoma 5. Além disso, grande parte da tecnologia usada em modelos do rato é aplicável ao estudo dos genes humanos, por exemplo, interrupções e substituição de genes alelos 6 . No entanto, a criação de um camundongo transgênico requer uma grande quantidade de recursos de natureza financeira e técnica. Vários projetos já começaram a compilar bibliotecas de knock out linhagens de camundongos (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) ou estirpes mutagênese induzida (RIKEN), que exigem esforços em larga escala e de colaboração 7. Portanto, é desejável para o primeiro estudo do fenótipo de um gene desejado em um modelo de cultura celular de células primárias antes de avançar para um modelo de mouse.

Retroviral DNA se integra ao DNA do hospedeiro, de preferência dentro ou perto de unidades de transcrição ou ilhas CpG, resultando em estável e hereditária expressão do gene de interesse embalados, evitando silenciamento transcricional 8 9. Os genes são transcritos, em seguida, sob o controle de um promotor retroviral de alta eficiência, resultando em uma alta eficiência de transcrição e produção de proteína. Portanto, a expressão retroviral pode ser usado com células que são difíceis de transfecção, desde as células estão em um estado ativo durante a mitose. Porque os genes estruturais do vírus estão contidos dentro da linha de célula de embalagem, os vetores de expressão usada para clonar o gene de interesse não contêm genes estruturais do vírus, que tanto elimina a possibilidade de revertentes viral e aumenta a segurança de trabalhar com sobrenadantes viral como não virions infecciosos são produzidos 10.

Aqui apresentamos um protocolo para a produção recombinante retroviral e subseqüente infecção de células B do baço. Após o isolamento, as células cultivadas esplênica são estimuladas com Th linfocinas derivadas e anti-CD40, o que induz a uma explosão de B proliferação e diferenciação celular 11. Este protocolo é ideal para o estudo de acontecimentos ocorridos no final B de desenvolvimento e diferenciação celular, como as células B são isolados do baço seguintes eventos iniciais hematopoéticas, mas antes da estimulação antigênica para induzir a diferenciação plasmocitária.

Protocol

1. Isolamento de Linfócitos B do baço e Estimulação Colher os baços de camundongos deficientes AID 12 entre 2-3 meses de idade. O isolamento do baço é realizada em condições estéreis e os órgãos mantidos temporariamente em soro fisiológico frio tampão fosfato (PBS) contendo 15% de soro fetal bovino (FBS). O baço é então transferido para um capuz estéreis de cultura de tecidos e homogeneizado em 5 mL de PBS suplementado com FBS 2,5%. Transferir o homogeneizado para um tub…

Discussion

Transdução retroviral de células B do baço, como descrito aqui e, conforme ilustrado na figura 1 é uma abordagem genética que é útil no estudo de linfócitos B, porque muitos dos eventos de desenvolvimento em lymphopoesis são controlados pela regulação da transcrição 1, 2. Nos estágios mais avançados da maturação das células B, provocando via CD40L é essencial para a indução de crescimento de células B, a entrada no ciclo celular, e proliferação de 11, 20. C…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CK é suportado pelo programa de Pós-Graduação da Universidade Columbia. UB é membro da Leukemia and Lymphoma Society of America, o destinatário da New Investigator Award da Fundação de Pesquisa leucemia e é apoiado pela Columbia University New Faculdade start-up fundos.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
FCS   Atlanta Biologicals S11550  
RPMI   Invitrogen/Gibco 22400  
PBS   Invitrogen/Gibco 20012  
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer   Sigma Aldrich R7757  
CD43 beads   Miltenyi    
B Cell Complete Media   Various components Various Components RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol
IL-4        
Anti-CD40   BD Pharmigen 553787  
polybrene   Sigma Aldrich 107689 
  
Chloroquine diphosphate salt   Sigma Aldrich C6628 Used at 100mM
Phoenix Eco cells (Murine)   Orbigen RVC-10002  
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220)   eBioscience 15-0452-81  
PE-α-mouse-IgG1   BD Pharmigen A85-1  

References

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Cite This Article
Keim, C., Grinstein, V., Basu, U. Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells. J. Vis. Exp. (48), e2371, doi:10.3791/2371 (2011).

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