نحن هنا تصف الرواية مقايسة لرصد امتصاص بريون والاتجار بها من قبل خلايا المناعة فورا بعد التلقيح داخل الصفاق عن طريق تنقية والتوسيم fluorescently قضبان بريون مجمعة من المواد في المخ المصابة ثم رصد واستيعاب الحركة من موقع الحقن وتتميز الخلايا التوسط في هذه الأحداث.
شكل وجود بروتين بريون الشاذ المضيف ترميز (PrPC) التي يتم البروتيني مقاومة ، ومرضية معدية يميز الأمراض البريونية مثل مرض الهزال المزمن (CWD) من cervids وسكرابي في الأغنام. فرضية بريون تؤكد أن هذا غير طبيعي الملتزم يشكل معظم أو كل من بريون المعدية. لقد كان دور جهاز المناعة في الأحداث في وقت مبكر المرضية بريون الطرفية مقنع لCWD و 1-3 سكرابي. وكشفت الصيدلانية المعدلة وراثيا والدراسات على الفئران دورا هاما في نظام المتممة في الاحتفاظ بها وتكرارها البريونات في وقت مبكر بعد الإصابة 4-6. في التجارب المختبرية والدراسات المجراة وقد لاحظ أيضا الاحتفاظ بريون بواسطة الخلايا الجذعية 7-10 ، على الرغم من أن دورها في الاتجار غير المشروع لا يزال يتضح 11-16. الضامة وبالمثل تورطت في بريون المرضية في وقت مبكر ، ولكن هذه الدراسات ركزت على الأحداث التي وقعت بعد اسابيع من العدوى 3،11،17. هذه الدراسات السابقة تعاني أيضا من مشكلة التمييز بين الذاتية وبي ار بي سي البريونات المعدية. نحن هنا وصف نصف كمي ، ونهج غير متحيز لتقييم امتصاص بريون والاتجار بها من موقع التطعيم من قبل خلايا المناعة المعينين هناك. وتنقية قضبان بريون مجمعة من الدماغ جناسة المصابين solubilization المنظفات غير مجمعة البروتينات وتنبيذ فائق من خلال وسادة السكروز. بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، coomassie الزرقاء تلطيخ والغربية النشاف الانتعاش مؤكدة قضبان بريون عالي التخصيب في كسر مكعبات. وكانت قضبان بريون ملون تألقي المسمى intraperitoneally ثم حقنه في الفئران. بعد ساعتين كان يعاير الخلايا المناعية من السوائل غسيل البريتوني والطحال والغدد الليمفاوية والمنصف للاحتفاظ المساريقي قضيب بريون وفرعية الخلية التي حددتها التدفق الخلوي متعدد الألوان باستخدام علامات لحيدات ، العدلات ، والخلايا الجذعية ، والضامة وباء ، والخلايا التائية. يسمح هذا الاختبار لرصد أول مرة مباشرة من الحصول على الخلايا المناعية والبريونات الاتجار في الجسم الحي في غضون ساعات بعد الإصابة. هذا الاختبار أيضا يفرق بوضوح المعدية ، والبريونات مجمعة من PrPC أعرب عن عادة على الخلايا المضيفة ، والتي يمكن أن يكون صعبا ويؤدي إلى مشاكل تفسير البيانات في أنظمة الفحص الأخرى. ويمكن تكييف هذا البروتوكول إلى طرق التلقيح الأخرى (في الوريد عن طريق الفم ، وintranervous تحت الجلد ، على سبيل المثال) والمستضدات (الخرز مترافق ، ومسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية والطفيلية والبروتينات ، والبيض) كذلك.
نحن هنا يبرهن على وجود علامات وبروتوكول للالبريونات تتبع في الجسم الحي الذي يسهل كثيرا رصد الأحداث في وقت مبكر من العدوى بريون الطرفية. هذا البروتوكول يحسن إلى حد كبير على المحاولات السابقة في امتصاص بريون الرصد في المختبر 9 و 3،12 في الجسم الحي…
The authors have nothing to disclose.
نشكر McBryant ستيف وجيف هانسن للحصول على مساعدة تنبيذ فائق وكايزر باتي للمساعدة في التعامل مع الفأرة. المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية في المعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة 5R01NS056379 – 02 تمول هذا العمل.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | ||
Blender | Oster | 6694-015 | Use any commercial blender | |
Centrifuge | Sorvall | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
Ultracentrifuge | Beckman | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | ||
Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11 836 170 001 | ||
Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power | |
DyLight antibody Labeling kit | Thermo Scientific | 53050 | ||
microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g | |
centrifugal filter columns | Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff | |
8-40 week-old FVB mice | Charles River | 207 | Use any inbred mouse strain | |
1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm | |
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | ||
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | ||
fluorescent antibodies | BD pharmingen | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. | |
flow cytometer | Dakocytomation | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |