Summary

Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Published: November 19, 2010
doi:

Summary

Hier beschreiben wir eine neuartige Assays für die Überwachung der Prion-Aufnahme und-handel durch Immunzellen sofort nach intraperitonealer Inokulation durch Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aggregierte Prion Stangen aus infizierten Gehirn Material dann die Überwachung ihrer Aufnahme und Bewegung an der Injektionsstelle und Charakterisierung der Zellen Vermittlung dieser Ereignisse.

Abstract

Vorhandensein einer anomalen Form eines Host-kodierten Prion-Protein (PrP), die Protease resistent, pathologische und ansteckend ist charakterisiert Prion-Erkrankungen wie das Chronic Wasting Disease (CWD) der Cerviden und Scrapie bei Schafen. Die Prion-Hypothese behauptet, dass dieses abnorme Konformer die meisten oder alle der infektiösen Prionen darstellt. Die Rolle des Immunsystems in der frühen Ereignisse in peripheren Prion Pathogenese konnte überzeugend für CWD und Scrapie 1-3 gezeigt. Transgene und pharmakologische Studien an Mäusen zeigten eine wichtige Rolle des Komplementsystems bei der Bindung und Replikation von Prionen früh nach der Infektion 4-6. In-vitro-und In-vivo-Studien haben auch Prionen Retention durch dendritische Zellen 7-10 beobachtet, obwohl ihre Rolle in Handel bleibt Unklar 11-16. Makrophagen sind ebenfalls in der frühen Prion Pathogenese in Verbindung gebracht, aber diese Studien haben sich auf Ereignisse, die Wochen nach der Infektion 3,11,17 konzentriert. Diese früheren Studien leiden auch unter dem Problem der Unterscheidung zwischen endogenen PrP C und infektiöse Prionen. Hier beschreiben wir eine semiquantitative, unvoreingenommene Herangehensweise für die Beurteilung der Prion-Aufnahme und-handel von der Impfstelle von Immunzellen rekrutiert dort. Aggregierte Prion Stäbe wurden aus infizierten Hirnhomogenat durch Waschmittel Solubilisierung von nicht aggregierten Proteinen und Ultrazentrifugation durch ein Saccharose-Kissen gereinigt. Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Coomassie Blau-Färbung und Western Blot bestätigt Erholung von hoch angereichertem Prion Stangen in die pelletierten Fraktion. Prion Stangen wurden Fluorochrom-markierte dann intraperitoneal in Mäuse. Zwei Stunden später Immunzellen aus Peritoneallavage Flüssigkeit, Milz und mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten wurden für Prion Stabrückhaltesystem und Zell-Untergruppen von multicolor Durchflusszytometrie unter Verwendung von Markern für Monozyten, Neutrophile, dendritische Zellen, Makrophagen und B-und T-Zellen identifiziert untersucht. Dieser Test ermöglicht es zum ersten Mal die direkte Überwachung der Immunzellen Erwerb und Handel mit Prionen in vivo innerhalb von Stunden nach der Infektion. Dieser Assay auch deutlich unterscheidet infektiöse, aggregiert Prionen aus PrPC in der Regel auf dem Host-Zellen exprimiert, die als schwierig und führt zur Interpretation der Daten Probleme in anderen Testsystemen können. Dieses Protokoll kann auch auf andere Impfung Routen (orale, intravenöse, intranervous und subkutanen, zB) und Antigene (konjugierte Beads, bakteriellen, viralen und parasitären Erregern und Proteine, Ei) als auch angepasst werden.

Protocol

1. Reinigung und Labeling Prion Rods Dieses Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten 18 angepasst Homogenisieren 100 Gramm Prion-infizierten Hirngewebe in 900 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer (HB, 1X PBS mit 320 mM Saccharose, 150 mM NaCl und 4mm EDTA) 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer kommerziellen Mixer, dann 2 min auf Eis. Dreimal wiederholen. Centrifuge Homogenat 10 min bei 3000 xg und 4 ° C. Entfernen Sie und speichern Sie auf…

Discussion

Hier zeigen wir ein Protokoll für die Kennzeichnung und Nachverfolgung Prionen in vivo, dass erleichtert die Überwachung frühen Ereignisse in peripheren Prion-Infektion. Dieses Protokoll verbessert auf die bisherigen Versuche mit Überwachung Prion-Aufnahme in vitro 9 und in vivo 3,12 von pre-Kennzeichnung hochangereichertes Prion Inokulum eindeutig unterscheiden sie von endogenen PrP C. Da infektiöse Prionen und PrP C die gleiche primäre Aminos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Steve McBryant und Jeff Hansen für die Hilfe bei Ultrazentrifugation und Patti Kiser für die Hilfe bei der Maus Handhabung. Das Nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall an den National Institutes of Health, gewähren 5R01NS056379-02 finanziert diese Arbeit.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
CWD-infected elk brain   Private elk farm in Colorado   Use any non-human prion-infected brain
Blender   Oster 6694-015 Use any commercial blender
Centrifuge   Sorvall SS34 rotor Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Ultracentrifuge   Beckman 50.2 Ti rotor Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Bradford Reagent   Sigma-Aldrich B6916  
Complete mini protease inhibitor cocktail   Roche 11 836 170 001  
Sonicator   Misonix MP4000X Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power
DyLight antibody Labeling kit   Thermo Scientific 53050  
microcentrifuge   Eppendorf 55430R Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g
centrifugal filter columns   Millipore Microcon YM-100 Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff
8-40 week-old FVB mice   Charles River 207 Use any inbred mouse strain
1 μm red fluorescent beads   Phosphorex 2307 Use any fluorescent bead ≤ 10 μm
RPMI 1640 medium   Invitrogen 11875-093  
40 μm cell strainer   Falcon 352340  
fluorescent antibodies   BD pharmingen Various Use any fluorescent antibody appropriate for your application.
flow cytometer   Dakocytomation CyanADP Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection

References

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Cite This Article
Johnson, T. E., Michel, B. A., Meyerett, C., Duffy, A., Avery, A., Dow, S., Zabel, M. D. Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection. J. Vis. Exp. (45), e2349, doi:10.3791/2349 (2010).

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