Summary

定量シナプス:シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

Published: November 16, 2010
doi:

Summary

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。

Abstract

神経科学における最も重要な目標の1つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子の合図を理解することです。このように、それはシナプス接続の変化を定量化するための客観的なアプローチを開発するために必要不可欠になっています。サンプルの固定から始まる、このプロトコルの詳細については、どのように解離神経細胞培養中および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。これらcolocalizationsの数は、ImageJの解析ソフトウェアのプラットフォームの下涙点アナライザ(リクエストも承りますバリーウォーク、、c.eroglu @ cellbio.duke.eduによって書かれた)プラグインを使用して定量される。このプロトコルで説明されているシナプスのアッセイは、選択前と後シナプスマーカーを持っている任意の神経組織や文化を準備するために適用することができます。このシナプスのアッセイは、広くシナプス開発の研究に利用することができる貴重なツールです。

Protocol

準備するソリューション: 抗体のバッファ: 150mMのNaCl 50mMトリス – 塩基(フィッシャー、カタログ番号:BP152 – 5、50mMの) – 1.21グラム 1%BSA(Sigma、カタログ番号:A2153、1%) – 2.0グラム 100mMのL -リジン(Sigma、カタログ番号:L – 1137、100mMの) – 3.65グラム 7.4にpHを調整する 0.04%アジ化蒸留H 2 Oで200mlにボリュームを調整</…

Discussion

上記のシナプスのアッセイは、我々の実験の目標、ここで我々は文化を精製や脳のセクションのいずれかで、大きくRGCsの興奮性の予測に焦点を当てるのコンテキストに基づいています。私たちは、興奮性シナプスを(表1)のラベルにうまく参照テーブルのリストの抗体を提供している。

このシナプスのアッセイは、任意の神経集団または選択的なプリと後シナプスマー…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ベンA.バレス(スタンフォード大学)の研究室で:涙点アナライザプラグインは、イメージのためにJはバリーウォーク(Physionコンサルティング現在のアドレス)によって書かれました。

資金調達;

  • アルフレッドP.スローン財団
  • エスターA.とジョセフKlingensteinファンド投資法人
  • 広範な生物医学研究財団
  • ハンチントン病のイニシアティブのために治す

Materials

  Antigen Species Monoclonal/Polyclonal Vendor Catalog Number Dilution Works in Culture Works in Sections
Presynaptic Synapsin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 106004 1:750 Y N.D.
Synapsin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 106001 1:500 Y Y
Bassoon Mouse Monoclonal Assay Designs VAM-PS003F 1:500 Y Y
Bassoon Guinea Pig Polyclonal Synaptic Systems 141004 1:1000 Y N.D.
Synaptotagmin 1 Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 105002 1:750 Y N
Synaptobrevin 2
(C1.69.1)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 104211 1:500 Y Y
Synaptophysin
(C1.7.2)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 101011 1:500 Y Y
VGlut1 Mouse Monoclonal Millipore MAB5502 1:2500 N Y
VGlut1 Guinea pig Polyclonal Millipore AB5905 1:2500 N Y
VGlut2 Guinea pig Polyclonal Millipore AB2251 1:2500 N Y
Postsynaptic PSD-95
(6G6-1C9 clone)
Mouse Monoclonal Affinity Bio Reagents MA1-045 1:750 Y N
PSD-95 Rabbit Polyclonal Zymed 51-6900 1:500 N Y
Homer Mouse Monoclonal Synaptic Systems 160011 1:500 Y N.D.
Homer Rat Polyclonal Millipore AB5875 1:500 Y Y
Gephyrin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 147003 1:500 Y Y
Gephyrin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 147 1:200 Y Y

Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.

Reagent Company Cat. No.
PBS Invitrogen 20012-027
poly-d-lysine Sigma P6407
Laminin Cultrex 3400-010-01
Triton X-100 Roche Diagnostics Gmbh 9002-93-1
Normal Goat Serum Gibco 16210
VectaShield with DAPI Vector Laboratories H-1200
OCT Tissue-Tek 4583
Tris-Base (50 mM) Fisher BP152-5
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
l-lysine Sigma L-1137
16% PFA solution Electron Microscopy Sciences 15711
Granular PFA Electron Microscopy Sciences 19210
24-well culture plate Falcon 35-3047
Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies Invitrogen
Supply Company Cat. No.
12mm, No. 0 glass coverslips Karl Hecht Gmbh 1105209
No. 1.5 glass coverslip (for slices) VWR Scientific 48393241
Glass slides VWR Scientific 48311-703

References

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Cite This Article
Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J. Vis. Exp. (45), e2270, doi:10.3791/2270 (2010).

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