פרוטוקול זה כרוך לא רדיואקטיבי<em> ב-situ</em> הליך הכלאה המאפשר זיהוי סימולטני של שני מינים התמליל, ברזולוציה של תא בודד, בסעיפים דק של המוח החולייתנים.
Abstract
כאן אנו מתארים גירסה שונה של פלואורסצנטי כפול<em> באתרו</em> (DFISH) שיטה הכלאה מותאם לאיתור two mRNAs עניין טרי חלקים במוח קפוא. הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה גישה זו במחקר גנטי משותף תקנה. באופן ספציפי יותר, השתמשנו בשיטה זו dFISH לחקור את ארגון אנטומי, תכונות neurochemical, ואת ההשפעה של החוויה החושית במעגלים החושית המרכזית, ברזולוציה של תא בודד. פרוטוקול זה קיבל תוקף ברקמת המוח של עכברים, חולדות ציפורי שיר אך צפוי להיות להתאמה בקלות למינים חוליות אחרים, כמו גם מערך של אי – עצביים לרקמות. בסרט זה אנו מספקים הפגנה מפורט של הצעדים העיקריים של הליך זה.
Protocol
פרוטוקול זה פותח ומעודן מבוסס על תקן ב-situ שיטות רדיואקטיבי ולא רדיואקטיבי הכלאה, שפותח בעבר על ידי אותנו ואחרים כדי לזהות אחד או שני מינים תמליל ברקמת המוח 1-7. פרוטוקול המתואר להלן בעל אורך כולל של 2 או 3 ימים, תלוי במספר הפרעות פרוצדורליות שנבחרו על ידי משתמ?…
Discussion
השתמשנו בפרוטוקול זה כדי ללמוד כיצד המוח חוליות מאורגן neurochemically והן מבחינה תפקודית, ולקבוע כיצד התנהגותית הרלוונטיים השפעת גירויים חושיים מנגנון גנטי של נוירונים במוח מבוגר 80-10. השתמשנו בשיטה זו בהצלחה ברקמת המוח של עכברים, חולדות, ציפורי שיר, אבל צופים כי פרוט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה נתמך על ידי מענקים של NIH / NIDCD וקרן שמיט אל RP.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
DEPC
VWR
IC15090225
toxic substance
PCR purification kit
QIAgen
28104
Formaldehyde
VWR
BDH0506-4LP
toxic substance
T3 RNA polymerase
Roche
11031163001
T7 RNA polymerase
Roche
10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)
VWR
IC816124
MgCl2 (1 M)
Sigma
449172
Spermidine (1 M)
Sigma
S0266
DIG RNA labeling mix
Roche
NC9380805
Biotin RNA labeling mix
Roche
NC9440104
RNasin
Promega
N2111
BSA
Sigma
05491
DTT
Sigma
D5545
Sephadex G50
VWR
95016-772
EDTA
VWR
101384-758
SDS
Sigma
L4390
Transfer (t)RNA
Invitrogen
15401011
10X MOPS
VWR
14221-398
toxic substance
Paraformaldehyde
VWR
AAAL04737-36
toxic substance
Sodium phosphate monobasic
Sigma
S3139
Sodium phosphate dibasic
Sigma
S3264
NaOH
VWR
SX0600-1
Triethanolamine
VWR
IC15216391
Acetic anhydride
VWR
MK242002
toxic substance
SSPE
VWR
82021-488
Formamide
VWR
JT4028-1
toxic substance
Poly A
Invitrogen
POLYA.GF
Mineral oil
VWR
IC15169491
Chloroform
VWR
BDH1109
organic solvent
Deionized formamide
Sigma
F9037
toxic substance
Hydrogen peroxide
VWR
VW36901
toxic substance
Tween 20
Sigma
P1379
Triton X-100
J. T. Baker
X198-05
Anti-DIG HRP
Roche
11093274910
Anti-biotin peroxidase
Vector
SP3010
TSA Alexa Fluor 594
Invitrogen
T20935
TSA Alexa Fluor 488
Invitrogen
T20932
Hoechst
VWR
200025-538
Vectashield
Vector
H-1000
embedding mold
VWR
15160-157
cryostat
Leica
CM 1850
Superfrost plus slide
VWR
89033-052
Solutions
Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).