우리는 설치류와 다양한 연령대의 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를, 소개하는 유전자 총을의 사용을 보여줍니다. 이 특정한 경우에, 우리는 성인 생쥐 (3-6개월 세) 및 성인 cynomologus 원숭이 (9-15년 이전)를 사용합니다. 원래 박사 Lichtman의 실험실에 의해 설명이 기술은 (간<em> 외</em세제가 낮은 농도로 유지하는 경우>., 2000), 잘 분기 돌기와 돌기 척추 형태의 연구에 가장 적합합니다 전통적인 immunostaining와 함께하실 수 있습니다.
DiOLISTIC 얼룩은 뇌의 슬라이스 (.; 오브라이언과 러미스, 2007; 간 외, 2000. 간 외, 2009)의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를 소개하는 유전자 총을 사용합니다. 여기서 우리는 기술을 설정할 때 도움이 될 것입니다 좋은 나쁜 결과의 모범적인 이미지와 함께 필요한 각 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리의 경험에서 몇 걸음 DiOLISTICS의 성공적인 응용 프로그램에 대한 중요한 증명. 이러한 고려 사항은 DiI – 코팅 총알의 품질, 정착액 노출의 범위 및 부화 솔루션에 사용되는 세제의 농도를 포함합니다. 일반적인 문제에 대한 도움말과 솔루션이 제공됩니다.
이 연령대의 광범위한 여러 동물 종 (种)에 적용할 수있는 다양한 분류 방법입니다. 그들은 형광 transgene의 표현에 의존하기 때문에 젊은 동물의 준비로 제한하거나 마우스로 제한 다른 형광 라벨 기술과는 달리, DiOLISTIC 라벨은 모든 연령, 종 및 genotypes의 동물에 적용할 수 있으며, 그것은 함께 사용할 수 있습니다 세포의 특정 subpopulation을 식별하는 immunostaining. 여기 dendrite 분기와 돌기 척추의 형태를 quantifying의 목적으로 성인 마우스 및 성인이 아닌 인간 영장류의 뇌 조각의 레이블 뉴런에 DiOLISTICS의 사용을 보여줍니다.
그것이 연령대의 다양한 다양한 종류의 조직 섹션에 적용하고, 조직에 신선한 또는 정착액 – perfused 동물에서 얻을 수 있기 때문에 DiOLISTIC 라벨링은 (또한 간 외 볼 찬란 라벨 세포에 사용할 수있는 가장 융통성있는 기술 중 하나입니다 . 2009 년). 이 과정은 1-2 일 정도가 소요로 비교적 빠른이며, 그것은 같은 immunostaining (리 외., 2006)와 같은 다른 많은 고전적인 분류 방법과 함께하실 수 있습니다. 이들은 lipophilic 막의 무결성을 구성하여 염료가 세포 밖으로 누출 원인이되므로 특별한주의가 고정과 부화 솔루션에 높은 세제 농도의 사용을 통해 피하기 위해 지불되어야합니다. 항체 침투가 낮은 농도로 용이 수있는 트리톤 X – 100 인큐베이션 솔루션 (리 외., 2006)뿐만 아니라 digitonin 또는 사포닌 (마쓰 바 야시 외., 2008). 이 기법에 적용할 수있는 몇 가지 수정은 간 외. (2000) 또는 항체 노출 (닐리 외., 2009)의 길이와 유형을 변경하여 설명한 여러 염료와 총알의 사용을 포함합니다.
전통적으로, DiI은 두뇌에의 연결을 계획을 추적하는 데 사용되었습니다. DiOLISTIC 라벨은 세포 형태를 검사하기 위해 유용한 방법을 설명하여 응용 프로그램을 확장합니다. 의 연결 형태 큰 관심 때문에 두뇌와 세포 모양은 신경 시스템의 연결 인구의 기능 다중성에 반영이 될지도 모른다는 추측에있는 큰 다양성이다. 이 중 한 예는 포유류의 신경 시스템의 디스플레이 작은 돌출부 많은 뉴런들이 시냅스 glutamatergic의 사이트에 아르 돌기 쪽이라는 사실이다. 이러한 방법으로 세포에 glutamatergic 시냅스의 밀도는 본 설명 라벨 기법을 사용하여 측정할 수 돌기 쪽이의 밀도에 상관하실 수 있습니다. 또한, 이러한 dendrite 전체 길이, 분기 패턴, 돌기 척추의 형상 및 밀도 등의 형태학의 매개 변수가 계량하고 공부하실 수 있습니다.
그것이 높은 해상도 공촛점 이미징을 허용하기 때문에 명시야 현미경 (예 : 잠돌군 Zz의 얼룩)에 의존하는 전통적인 기법과 비교의 연결 형태를 공부에 대한 형광 상표의 사용은 많은 장점이 있습니다. 형태 돌기 척추 밀도를 측정하기위한 실험에 형광단로 DiI을 사용의 또 다른 이점은 lipophilic 속성입니다. DiI의 플라즈마 막으로 파티션하고의 연결 프로세스와 돌기 라고나할까요의 잘 정의된 개요를 제공합니다. 대부분의 돌기 쪽이 (이하 한 femtoliter)의 소량을 감안할 때, 멤브레인 얼룩이보다 효율적이고 세포질 얼룩보다 작고 얇은 라고나할까요보다 시각화를위한 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리가 그들의 공촛점 현미경에 대한 액세스 기술과 박사 후미 오노의 실험실 최대 초기 설정 중에 도움 마이클 Feyder와 테럴 홀로을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 NIAAA와 NINDs의 교내 프로그램을 통해 건강의 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) | Invitrogen | D-282 | ||
Methylene chloride | Mallinckrodt Chemicals | H485-06 | ||
Tungsten beads | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm diameter | |
Polyvinylpyrrolidone | Calbiochem | 529504 | ||
Tefzel bullet tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
Helios Gene Gun | Bio-Rad | 165-2431 | ||
Isopore membrane filter paper | Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm pore size | |
ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | ||
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |