Overview
Denne video beskriver dyrkning af brystkræftceller støder op til lårben knogle explants at måle kræft cellespredning og kolonisering i et humant knoglevæv explant model system.
Protocol
1. Co-dyrkning af brystkræftceller støder op til knoglefragmenter til måling af spredning af brystceller ved hjælp af BLI
- Forud for forsøget skal du forberede en suspension, der indeholder 2 x10 5 brystkræftceller/50 μl, og forberede stik af knoglevoks til immobilisering af knoglefragmenter i kulturen. Skær en P200 micropipette spids i 3 stykker og bruge den smalle ende af det største stykke i en "cookie cutter" måde at skære små (~ 35 mg) stykker knoglevoks. Brug den brede ende af det mindste stykke til at skubbe knoglevokspropperne ud i en petriskål til opbevaring.
- Placer et stykke knoglevoks på 12 klokken position af hver brønd og forsigtigt trykke ned med en steril-behandsket pegefinger.
- Pipette 50 μl celleaffjedring indeholdende 1 x10 5 brystkræftceller i DMEM-10% FBS + Pen-Strep i midten af hver brønd af en 6-brønds plade. (Alternativt kan du finde celler i et spredt mønster, hvis det ønskes). Pladen anbringes i en 37 °C vævskulturinkubator i 45 minutter for at fremme celletilbehør.
- Placer 1 knoglefragment på 1 stykke knoglevoks for hver eksperimentel brønd og påfør blidt tryk med rongeuren for at sikre den. Udfør forsøg med tre eksemplarer, således at 3 knoglefragmenter fra en given THR-prøve placeres i de tre øverste brønde, mens de nederste tre brønde kun indeholder knoglevoks som kontrol.
- Ved hjælp af en 5 ml pipette, forsigtigt og langsomt levere 5 ml DMEM-10% FBS til siden af hver brønd for at undgå at løsne brystceller eller knoglefragmenter. Pladen anbringes i en 37 °C vævskulturinkubator i 20-24 timer.
- For at udføre bioluminescensbilleddannelse (BLI) fjernes pladen fra inkubatoren og tilsættes luciferinunderlag (for at opnå en koncentration på 300 μg/ml) til hver brønd. Billede pladen straks på en IVIS Imaging Platform ved hjælp af følgende parametre: f-stop på 1, lille binning, eksponeringstid på 1 sek, niveau D. Mål signalintensiteten af hver samt gennemsnitlig udstråling (fotoner / anden / kvadratcentimeter / steradian).
- Brug billedbehandlingssoftware til at definere ROI (Regions of Interest) for at kvantificere den gennemsnitlige udstråling for alle forsøgs- og kontrolbrønde. Eksportere gennemsnitlige udstrålingsværdier til et Excel-ark for at udføre statistik og generere grafer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/ Strep |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 |