Summary

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Published: July 20, 2010
doi:

Summary

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Abstract

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) is uiterst nuttig voor het visualiseren van microglia, oligodendrocytic, astrocytaire, en neuronale subcellulaire compartimenten (dendriet, dendritische wervelkolom, axon, axon terminal, perikaryon), evenals hun intracellulaire organellen en cytoskelet, in het centrale zenuwstelsel bij hoge ruimtelijke resolutie. In combinatie met TEM, pre-embedding immunocytochemie kan de discriminatie van cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria (bv. microgliale perikarya en processen, bij het gebruik van een antilichaam tegen de microglia-specifieke marker Iba1 (geïoniseerd calcium binding adapter molecuul 1; zoals gepresenteerd hier)), het identificeren van de neurotransmitter inhoud van cellulaire elementen (bijvoorbeeld serotonine) en hun ultrastructurele lokalisatie van oplosbare of membraan-gebonden eiwitten (bijv. 5 HT1A en EphA4 receptoren). We beschrijven hier een protocol voor transcardiac perfusie van muizen met acroleïne fixatief, verwijdering en snijden van de hersenen, evenals immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) kleuring, hars inbedding, en de ultradunne snijden van de hersenen secties. Na voltooiing van deze procedures, de immunostained materiaal klaar is voor onderzoek met TEM. Bij het rigoureus uitgevoerd, deze techniek biedt een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie.

Protocol

1. Dier perfusie Op de dag voor perfusie, voor te bereiden: – 2 L van fosfaatbuffer (PB, 100 mM, pH 7,4) en een L van natrium fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,9% NaCl in 50 mM PB, pH 7,4) in dubbel gedistilleerd water. Bewaar de PBS en 1L van PB bij 4 ° C. Deze zullen worden gebruikt voor perfusie en pre-inbedding immunocytochemie. – 1L van 4,0% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4) fixatief oplossing, die de doorbloeding van 6 muizen in staat zal stellen. Voor dat doel, warmen een L van PB in…

Discussion

Hier hebben we beschreven een protocol voor de voorbereiding van de hersenen van muizen weefsel voor immunoelectron microscopie, dat een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie, wanneer de procedures zorgvuldig worden uitgevoerd biedt.

In combinatie met TEM, deze methode maakt het mogelijk om onderscheid te maken cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria. Met name de immunoperoxidase-DAB kleuring v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Shao-Ming Lu en Harris A. Gelbard voor het gebruik van een peristaltische pomp en vibratome, evenals Karen L. Bentley en Gayle Schneider op de Electron Microscope Onderzoek Core Facility van de Universiteit van Rochester Medical Center voor technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund, en de Alfred P. Sloan Foundation om AKM. M.-È.T. wordt gefinancierd door een Fonds de la recherche en sante du Quebec (FRSQ) post-doctorale opleiding award.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sodium pentobarbital (Nembutal)   Ovation Pharmaceuticals    
Filter paper 315 24 cm   VWR 28331-081  
*Acrolein purum (≥95%)   Sigma-Aldrich (Fluka) 01680  
Sodium borohydride (≥98%)   Sigma-Aldrich (Aldrich) 452173  
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%)   Sigma-Aldrich 441244  
Normal goat serum   Jackson ImmunoResearch 005-000-121  
Rabbit anti-Iba1 primary antibody   Wako 019-19741 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific   Jackson ImmunoResearch 111-066-046 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
Peroxidase-conjugated streptavidin   Jackson ImmunoResearch 016-030-084 Stored at -20°C, 1:1 in glycerol
*Osmium tetroxide 4% solution   Electron Microscopy Sciences 19150 Light sensitive
Propylene oxide (≥99%)   Sigma-Aldrich (Fluka) 82325  
Polypropylene disposable beakers (50 mL)   Fisher 01-291-10  
Aluminium weigh dishes (70 mm)   Fisher NC9261784  
Durcupan epoxy resin   Electron Microscopy Sciences 14040  
Embedding mold   Electron Microscopy Sciences 70907  
DPX mountant for histology   Sigma-Aldrich (BioChemika) 44581  
Gelatin subbed slides   VWR 100241-864  
ACLAR embedding films (7.8 mm)   Electron Microscopy Sciences 50425  
Capsule mold   Electron microscopy Sciences 70150  
High-performance super glue   Corporate Express LOC30379  
Perfect loop for ultra thin sections   Electron Microscopy Sciences 70944  
Superfrost slides   Fisher 22-178-277  
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm)   Diatome    
Gelatin from cold water fish skin (~45%)   Sigma-Aldrich (Sigma) G7765  

*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.

Play Video

Cite This Article
Tremblay, M., Riad, M., Majewska, A. Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (41), e2021, doi:10.3791/2021 (2010).

View Video