Измерение жесткость на изгиб бактериальных клеток Использование оптической ловушки

Расти клетки E.coli в Лурия-Beltrani бульона (LB) среды к экспоненциальной фазы (OD = 0,2-0,4). Рост культуры в LB дополнена с 50 мкг / мл цефалексин в течение 15 мин, чтобы вызвать рост нитчатых, а затем сосредоточиться культуры в 5 раз путем центрифугирования. Сделать PEI покрытием покровное путем пропускания 1% полиэтиленимина, разбавленным водой в проточную камеру, а также мыть с водой после 5-минутной инкубации. Поток концентрированного культуре клеток в камере, и промывают смесью LB и цефалексин (50μg/mL) через 3 мин, чтобы удалить одиноких клеток. Инкубируйте камере при температуре 37 ° С в течение 30 мин-1 час, чтобы прилагается клетки растут перед размещением на оптический инструмент захвата. Сделать полилизином покрытием бусин путем инкубации 0,5-мкм диаметром полистирола (Bangs Labs) в 0,1% полилизином разводят в воде в течение 30 мин. Затем промыть бисером 3 раза и ресуспендируют в воде. Развести бусинка решение по два раза в LB с цефалексин (50μg/mL), и добавить его в проточную камеру. Оптически ловушку плавающего шарика и прикоснуться к ней, чтобы свободный кончик клетки. (Мы используем Безумный город Labs пьезо этапе управления движением образца.) Когда подходящий шарик / элемент комбинации найден, мыть камеру с цефалексин в LB (50μg/mL), чтобы удалить одиноких бисером. Выполнить заказ письменного LabView программу применить изгибающие силы к клетке и записи сила-смещение данных. Детали программы Калибровка детектора путем сканирования растровых прилагается шарик внутри пучка лазерного обнаружения и записи 3D PSD сигналы напряжения. Определить клетка длинная ось в микроскопе изображение. Переместить ячейки шаги в направлении, перпендикулярном к ячейке длинной оси. Запись расстоянии двигался и смещения от оптической ловушке. Преобразование смещение приложенной силы с использованием ранее измеряется ловушку жесткость и сохранить смещение наконечника и силой в файл. Секреты успеха: В шаге 8), нужно найти ячейки с четко определенными застряли конца. Некоторые клетки просто застрял на один наконечник, и изгибающего усилия на другом кончике приводит к цельноклеточная поворотным, а не гибки. Подходящей пары находят изгиба каждой клетки быстро вручную с помощью джойстика контролируемой стадии движения. Представитель Результаты: Рисунок 1. На этом рисунке показана сила-смещение данных по одной ячейке. Наклон этой линии изгибной жесткости клетки.