לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl
Summary
צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.
Abstract
שילוב של שלפוחית סינפטית עם קרום הפלזמה (exocytosis) היא צעד נדרש שחרור הנוירוטרנסמיטר ותקשורת עצבית. שלפוחית מאוחזרות אז מן הקרום פלזמה (אנדוציטוזה) ו מקובצים יחד עם בריכה הכללית של שלפוחית בתוך הטרמינל העצב, עד שהם עוברים exo-וחדשים מחזור אנדוציטוזה (מיחזור שלפוחית). תהליכים אלה נחקרו תוך שימוש במגוון טכניקות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, הקלטות electrophysiology, amperometry ומדידות קיבול. חשוב לציין, במהלך שני העשורים האחרונים מספר סמנים שכותרתו fluorescently יצא, המאפשר לעקוב אחר שיטות אופטיות שלפוחית בדינמיקה מיחזור שלהם. אחד הסמנים הנפוץ ביותר הוא styryl FM או צבע 1; מבנית, כל צבעי FM מכילים ראש הידרופילי וזנב lipophilic מחובר דרך טבעת ארומטיים אחד או יותר קשרים כפולים (איור 1B). הניסוי הקלאסי לצבוע FM לתייג מאגר של שלפוחית מורכב רחצה והכנת (איור 1Ai) עם צבע במהלך גירוי של העצב (חשמלית או עם K גבוה +). זה גורם מיחזור שלפוחית והעמסת הבאות של צבע לתוך שלפוחית endocytosed לאחרונה (איור 1A I-III). לאחר טעינת שלפוחית עם צבע, סיבוב שני של גירוי באמבטיה לצבוע חופשי היה לעורר את שחרורו FM דרך exocytosis (איור 1A IV-V), תהליך שיכול להיות מלווה ניטור הירידה בעוצמת הקרינה (destaining).
למרות צבעים FM תרמו רבות בתחום מיחזור שלפוחית, לא ניתן לקבוע את לוקליזציה מורפולוגיה המדויק או של שלפוחית הפרט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. מסיבה זו, נסביר כאן כיצד צבעים FM יכול לשמש גם כסמנים endocytic באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, דרך photoconversion. הטכניקה photoconversion מנצל את המאפיין של צבעי ניאון כדי ליצור מינים חמצן תגובתי תחת תאורה חזקה. ההכנות שכותרתו fluorescently שקועות פתרון המכיל diaminobenzidine (DAB) ו מואר. מינים הריאקטיבי שנוצר על ידי מולקולות צבען לחמצן DAB, המהווה לזרז יציבה, מסיס בעל מראה כהה ניתן להבחין בקלות במיקרוסקופ אלקטרונים 2,3. כפי DAB הוא מתחמצן רק בסביבה הקרובה של מולקולות ניאון (כמו מינים החמצן מגיב הם קצרי חיים), הטכניקה מבטיח כי מבנים שכותרתו fluorescently רק הולך להכיל את המשקע אלקטרונים צפופה. הטכניקה ובכך מאפשר ללמוד את המורפולוגיה של המיקום המדויק של פעיל מיחזור האברונים.
Protocol
Discussion
צעדים קריטיים כמה צריכה להילקח בחשבון:
- הדגירה DAB צריכה להתבצע רק לאחר שטיפה יסודית של מרווה ההכנות. אחרת glutaraldehyde לא הגיבו יהיה אינטראקציה עם DAB ולגרום המשקעים שלה (בדרך כלל בצורה של גבישים שטוחים, שאינם אלקטרונים צפוף…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
