この研究は、前臨床抗菌評価で使用するために G.mellonella 感染モデルを最適化するための標準化されたフレームワークを示しています。 G. mellonella モデルを前臨床抗菌薬開発パイプラインの一部として適用することで、臨床試験に進む効果のない化合物の数を減らすことができるかもしれません。
世界的に高まる抗生物質耐性の問題に立ち向かうためには、新規抗菌薬の開発を加速させることが不可欠です。現在の前臨床抗菌薬開発では、臨床試験前または臨床試験中に不適切であることが証明されたリードが相当数得られています。前臨床開発の効率を高めるためには、関連性があり、標準化され、アクセスしやすく、費用対効果の高いモデルを開発する必要があります。 Galleria mellonella (オオガロガ)の幼虫は、微生物の病原性を評価するための感染モデルとして広く使用されており、薬物毒性試験を実施し、新規抗菌化合物の 生体内 有効性を評価する予備的な手段として機能します。これらの感染モデルは、同等のスループットを持つ多くのin vitroスクリーニングよりも生物学的関連性が高く、抗菌試験のプレスクリーニングとして使用すると、哺乳類モデルへの依存度が低下します。このプロトコルは、 G. mellonella 感染モデルの最適化のための標準化された方法論を説明しています。これは、細菌種や選択した抗菌治療薬に適用できます。WHOの優先病原体である 緑膿菌 を例に、再現性のある感染モデルと治療的検査を開発するために実行できる手順を概説します。これには、実験のセットアップ、サンプル調製、感染および治療プロトコルに関する推奨事項が含まれます。このモデルを前臨床抗菌薬開発パイプラインに統合することで、哺乳類モデルへの依存度が減少し、臨床試験に到達する効果のない化合物の数が減り、最終的には前臨床抗菌薬開発の効率が向上します。
Galleria mellonella(オオオカゲ)の幼虫は、微生物種の感染モデルとして、また新規薬物化合物の毒性試験として、生物科学全体で広く使用されています1,2。これらは、ハイスループットであり、ヒト感染の不可欠なin vivo特性を再現し、研究における哺乳類種の倫理的使用を規定する削減、改良、および置換の原則に沿って哺乳類モデルへの依存を減らすため、前臨床抗菌試験パイプラインでかなりの有用性を持つ可能性があります。
新しい抗菌薬の開発には、臨床検証に先立って、 in vitro および in vivo モデルで広範な前臨床試験を行う必要があります3。有望な前臨床データパッケージを持つ新規薬剤はごくわずかで、この高い離脱率の1つは、感染環境の複雑さを捉えるための前臨床スクリーニングの失敗です4。これらの問題は、臨床への抗菌薬の翻訳率が低いだけでなく、後期前臨床スクリーニングにおける実験脊椎動物の使用の増加にも寄与しています。新規抗菌薬の前臨床評価を改善し、高価で時間がかかり、複雑で倫理的に問題のあるマウス のin vivo モデルの使用を減らすためには、脊椎動物系での試験に進む見込みのない化合物の数を減らす、より優れた初期段階の薬物スクリーニングツールが必要です。
G. mellonellaは、卵、幼虫、蛹、成虫の4つの生活段階からなる8週間の短いライフサイクルを有し、そのうちの幼虫の形態は、このプロトコル1で利用されています。G. mellonellaは、専門の機器や専用の動物研究施設を必要とせずに、実験全体を通して簡単にメンテナンスできます。それらの使用について倫理的承認を求める必要はなく、研究者は実験品質を改善するために生物を社内で繁殖させることができます2,5,6,7。G. mellonellaの免疫系は、哺乳類の自然免疫系と非常によく似ており、「自己」および「非自己」の刺激に応答する能力を持っています8。血球は、病原体に関連する分子パターン認識とその後の食作用に関与しており、ヒトの好中球と機能的に類似した役割を果たしています9。G. mellonellaは、配列によってヒトとの相同性によって同定された3種類のToll様受容体をコードし、非自己物質を認識し、フェノロキシダーゼのメラニン10への活性化および重合に続いて局在するメラニン化複合体を形成する補体様タンパク質を産生します。これは、感染実験中にキューティクルがメラニン化によって暗くなるため、幼虫の健康状態を視覚的に読み取るのに役立ちます。ただし、フェノールオキシダーゼを含む昆虫のメラニン化軸は、哺乳類のチロシナーゼ-メラニン軸とは大きく異なることに留意すべきである11,12。さらに、G. mellonellaは、リゾチームやディフェンシンホモログ13を含む18の誘導性抗菌ペプチドを産生する。この類似性に加えて、モデルの単純な幼虫の維持手順と高スループットの性質により、G. mellonella は新薬の評価に広く利用される生物となっています。前臨床抗生物質の開発において、G. mellonellaは、能動免疫を持つ複雑な環境での宿主-病原-薬物相互作用をより正確にモデル化できるため、in vitroモデルと比較して有用性が向上しています。
現在、ヨーロッパにはG.mellonellaの標準化された研究グレードのサプライヤーはありません。研究者は代わりに、餌屋からG.mellonellaの幼虫を購入するか、独自のコロニーを維持する必要があります。G. mellonellaのコロニーを社内で維持する方法が説明されており、実験の一貫性を高めることができます5,6,7、この選択肢は、幼虫を頻繁に使用する人々にとってのみ魅力的である可能性があります。そのため、このプロトコルは、生き餌の供給者から幼虫を購入した後の実験設定に焦点を当てています。この方法は、よりアクセスしやすい一方で、実験の複雑さを増し、サプライヤーから幼虫を受け取る時点での幼虫の健康状態に一貫性がないため、アッセイに追加のばらつきをもたらす可能性があります。学術界、産業界、規制当局がG.メロネラ試験を前臨床抗菌薬開発パイプラインの一部として受け入れ、採用するためには、抗菌薬の有効性の最適化と評価のための標準化されたシステムが必要です。
この研究は、抗生物質開発のためのG.mellonella感染モデルの実験デザインを最適化します。G. mellonella感染モデルが記載されているが14,15、本方法論は、供給の不一致によってもたらされる追加の複雑さを軽減するための追加のステップを文書化し、新規抗菌薬の評価のためのフレームワークを提供する。テストケースとして、G. mellonellaをWHO優先1の病原体である緑膿菌に感染させ、アミノグリコシド剤(トブラマイシン)による治療を最適化しました。図1に示すこのフレームワークは、新規薬剤を用いた将来の前臨床抗菌スクリーニング研究の基盤となります。
薬剤耐性(AMR)の負担は増加の一途をたどっています。2019年には、世界中で推定495万人がAMRに関連して死亡しました30。2050年までに、AMRによる死亡率は1,000万人に達すると推定されています31。このリスクに対処するには、新規抗菌薬を効率的かつ費用対効果の高い方法で開発および試験する必要があり、抗菌薬の有効性を正確に予測する前臨床モデルを使用する必要があります。臨床試験への転換中に観察される高い離脱率は、主要な制限要因です。1件の研究では、臨床試験で失敗した13の抗菌薬候補が報告されており、11の抗菌薬候補は第II相32に進行しませんでした。
本研究は、G. mellonellaの前臨床抗菌薬スクリーニング研究の最適化のためのフレームワークと、抗菌薬の有効性を評価するための方法を提供します。G. mellonellaの幼虫は、薬物毒性の評価、MIC測定、および病原性試験において大きな有用性を持ち、前臨床開発に使用される哺乳動物の減少に貢献しています。Galleria mellonellaの幼虫は比較的高いスループットを持ち、生物学的に関連性があり、より複雑な哺乳類モデルにうまく変換されます。一方、野生型の実験用マウスは1匹あたり8ポンドから30ポンドの費用がかかり、マウス1匹あたり週7ポンドのメンテナンスが必要ですが、G. mellonellaは50匹の幼虫に対して~2ポンドの費用がかかります。したがって、G. mellonellaモデルで10種類の化合物をテストするには、~60ポンドの費用がかかりますが、マウスでの同じ研究では4000ポンド以上かかります。さらに、以前の研究では、新規化合物の毒性と有効性を比較し、G.メロネラとマウスの急性毒性との相関関係を特定しました8,19,33。したがって、マウスモデルでさらに試験する化合物に優先順位を付けるために、G. mellonellaスクリーニングを実装することをお勧めします。
このモデルの明らかな有用性にもかかわらず、アプリケーションを成功させるためには、いくつかの考慮事項があります。エタノール滅菌が必要であったり、研究者が自分自身のG.メロネラコロニーを維持する必要があるため、研究グレードの無菌幼虫がいないため、実験使用の準備が複雑になります。これにより、汚染のリスクが軽減され、全体的な実験品質が向上します5,6。不適切な滅菌はかなりの死亡率をもたらす可能性があり、エタノールへの曝露時間が長くなると死に至るため、生物を完全に滅菌することは困難です。滅菌の代替方法には、感染前に各幼虫の前脚を70%エタノールで拭くことが含まれ、これにより滅菌中の死亡率は減少しますが、より労働集約的な方法です。他の消毒剤も使用できますが、この研究では代替薬は評価されていませんでしたが、エタノール滅菌を最適化すると<10%の死亡率が得られました。さらに、供給者が自身のコロニーを維持するのではなく、他の供給者から幼虫を調達する可能性があるため、供給者がG. mellonellaを抗生物質で治療しているかどうかは不明であることが多い。
G. mellonella の生物学は哺乳類とはかなり異なり、その有用性には制限があります。彼らの免疫系には適応免疫がありませんが、自然免疫の主要な可溶性および細胞性の側面は存在します。血球は 、G. mellonella の主要な自然免疫防御であり、食細胞様の特性を示します。 これらの細胞の種々のサブセットが、とりわけ顆粒球および形質細胞を含む記載されている34。 G. mellonella は、呼吸器感染症や膀胱感染症などの関連する感染部位を再現することもできません。しかし、前臨床パイプラインでは、 G. mellonella はマウスモデルの事前スクリーニングとして機能し、最も有望な化合物のみが、ヒトの感染環境により近い複雑な哺乳類系に進むことを保証します。最後に、このモデルは、G. mellonellaのさらなるゲノム特性評価から、臨床的に重要なバイオマーカーの変化を評価するための適合性を判断するための利点を得るでしょう。特に、 G. mellonella の免疫についての理解を深める必要があります。
全体として、 Galleria mellonella 感染モデルは、哺乳類モデルで新規抗菌化合物を評価する前に、その前臨床評価のための貴重なツールです。供給の標準化が進んでいないため、その使用は複雑ですが、その用途はハイスループットでシンプルで、抗菌薬開発のランドスケープ全体に広く適用できます。将来的には、このモデルを標準化された前臨床パイプラインに統合することで、新しい抗菌化合物の開発を加速し、前臨床試験から臨床試験に進む候補の割合を増やすことができるかもしれません。
The authors have nothing to disclose.
TB、AK、JF、DNは、戦略研究センター(SRC)の「嚢胞性線維症における抗菌治療薬の開発のためのエビデンスに基づく前臨床フレームワーク」(PIPE-CF;課題番号SRC 022)を英国嚢胞性線維症トラストおよび米国嚢胞性線維症財団から発行しました。LDとJFは、Kidney Research North West(プロジェクトNo.49/19)からの資金提供を認めています。
22s gauge, Small Hub RN Needle, 2 in, point style 2 | Hamilton | 7758-03 | Replacement for the Hamilton syringe. |
Bacterial infection stocks | Bacterial stocks of a known density (CFU/mL) frozen during mid-exponential phase of growth. | ||
Ethanol | Fisher Scientific | 10610813 | Other manufacturers may be used. |
G. mellonella larvae | Livefoods | 5.06045E+12 | For this supplier, orders are marked as “New stock for lab use”. As of April 2024, new stock is delivered to the supplier on Mondays. Orders should be placed then, for delivery on Wednesdays. |
Microliter syringe | Hamilton | 80630 | The 80630 syringe has a 100 µL capacity. Other volumes exist, such as the 80430, 80530 or 80730. |
Petri dish | Fisher Scientific | 12674785 | Other manufacturers may be used. |