Cette étude présente un cadre normalisé pour l’optimisation des modèles d’infection à G. mellonella en vue de leur utilisation dans l’évaluation préclinique des antimicrobiens. L’application d’un modèle de G. mellonella dans le cadre d’un pipeline de développement préclinique d’antimicrobiens pourrait réduire le nombre de composés inefficaces progressant vers les essais cliniques.
Pour lutter contre le problème mondial croissant de la résistance aux antibiotiques, il est essentiel d’accélérer le développement de nouveaux antibiotiques. Le développement préclinique actuel des antimicrobiens produit un nombre important de pistes qui s’avèrent inappropriées avant ou pendant les essais cliniques. Pour augmenter l’efficacité du développement préclinique, des modèles pertinents, standardisés, accessibles et rentables doivent être développés. Les larves de Galleria mellonella (grande teigne de la cire) sont largement utilisées comme modèle d’infection pour évaluer la virulence microbienne, effectuer des tests de toxicité des médicaments et servir de moyen préliminaire d’évaluation de l’efficacité in vivo de nouveaux composés antimicrobiens. Ces modèles d’infection ont une plus grande pertinence biologique que de nombreux dépistages in vitro de débit comparable et réduisent la dépendance aux modèles de mammifères lorsqu’ils sont utilisés comme prédépistage pour les tests antimicrobiens. Ce protocole décrit une méthodologie normalisée pour l’optimisation des modèles d’infection à G. mellonella , qui peut être appliquée aux espèces bactériennes et aux traitements antimicrobiens de votre choix. En utilisant l’agent pathogène prioritaire de l’OMS Pseudomonas aeruginosa comme exemple, nous décrivons les étapes qui peuvent être entreprises pour développer un modèle reproductible d’infections et de tests thérapeutiques. Cela comprend des recommandations sur le montage expérimental, la préparation des échantillons et les protocoles d’infection et de traitement. L’intégration de ce modèle dans les pipelines de développement préclinique d’antimicrobiens réduirait la dépendance à l’égard des modèles de mammifères, réduirait le nombre de composés inefficaces atteignant les essais cliniques et, en fin de compte, augmenterait l’efficacité du développement préclinique d’antimicrobiens.
Les larves de Galleria mellonella (la grande teigne de la cire) sont largement utilisées dans les sciences biologiques comme modèles d’infection pour les espèces microbiennes et pour les tests de toxicité de nouveaux composés médicamenteux 1,2. Ils ont le potentiel d’être considérablement utiles dans un pipeline d’essais antimicrobiens précliniques, car ils sont à haut débit, reproduisent les caractéristiques intégrales in vivo de l’infection humaine et réduisent la dépendance à l’égard des modèles de mammifères, conformément aux principes de réduction, de raffinement et de remplacement qui régissent l’utilisation éthique des espèces de mammifères dans la recherche.
Le développement de nouveaux antibiotiques nécessite des tests précliniques approfondis sur des modèles in vitro et in vivo avant la validation clinique3. Seuls quelques nouveaux agents avec des ensembles de données précliniques prometteurs se traduisent en clinique, et l’un des facteurs contribuant à ce taux d’attrition élevé est l’incapacité des dépistages précliniques à saisir les complexités des environnements infectieux4. Ces problèmes contribuent non seulement à un faible taux de traduction des agents antimicrobiens en clinique, mais aussi à une utilisation accrue d’animaux vertébrés de laboratoire lors du dépistage préclinique à un stade avancé. Afin d’améliorer l’évaluation préclinique des nouveaux antimicrobiens et de réduire l’utilisation de modèles murins in vivo coûteux, longs, complexes et problématiques sur le plan éthique, de meilleurs outils de dépistage de médicaments à un stade précoce sont nécessaires pour réduire le nombre de composés peu prometteurs qui progressent jusqu’aux tests dans les systèmes vertébrés.
G. mellonella a un court cycle de vie de 8 semaines, composé de quatre stades de vie : œuf, larves, pupes et adultes, dont la forme larvaire est utilisée dans ce protocole1. G. mellonella est facile à entretenir tout au long d’une expérience sans avoir besoin d’équipement spécialisé ou d’une installation de recherche animale dédiée. Il n’est pas nécessaire d’obtenir une approbation éthique pour leur utilisation, et les chercheurs peuvent sélectionner l’organisme en interne pour améliorer la qualité expérimentale 2,5,6,7. Le système immunitaire de G. mellonella ressemble beaucoup à celui du système immunitaire inné des mammifères, avec la capacité de répondre aux stimuli du « soi » et du « non-soi »8. Les hémocytes sont responsables de la reconnaissance des formes moléculaires associées aux agents pathogènes et de la phagocytose qui en résulte, jouant un rôle fonctionnellement analogue à celui des neutrophiles chez l’homme9. G. mellonella code pour trois types de récepteurs de type Toll qui ont été identifiés par homologie de séquence avec l’homme, et produit des protéines de type complément, qui reconnaissent le non-soi matériel et forment des complexes de mélanisation localisés après l’activation et la polymérisation de la phénoloxydase en mélanine10. Cela peut servir de lecture visuelle de la santé des larves pendant les expériences d’infection, car la cuticule est assombrie par la mélanisation. Il convient toutefois de noter que l’axe de mélanisation chez les insectes, qui implique la phénoloxydase, diffère considérablement de l’axe tyrosinase-mélanine chez les mammifères11,12. De plus, G. mellonella produit 18 peptides antimicrobiens inductibles, y compris des homologues du lysozyme et de la défensine13. Cette similitude, ainsi que les procédures simples d’entretien des larves et la nature à haut débit du modèle, ont fait de G. mellonella un organisme largement utilisé dans l’évaluation de nouveaux médicaments. Dans le développement préclinique d’antibiotiques, G. mellonella a une utilité accrue par rapport aux modèles in vitro, car ils peuvent modéliser avec plus de précision les interactions hôte-pathogène-médicament dans un environnement complexe avec une immunité active.
À l’heure actuelle, il n’existe pas de fournisseur normalisé de G. mellonella en Europe. Les chercheurs doivent plutôt acheter des larves de G. mellonella dans des magasins d’appâts ou maintenir leur propre colonie. Bien que des méthodes pour maintenir une colonie interne de G. mellonella aient été décrites et puissent augmenter la cohérence expérimentale 5,6,7, cette option n’est susceptible d’être attrayante que pour ceux qui utilisent fréquemment les larves. En tant que tel, ce protocole se concentre sur le dispositif expérimental suite à l’achat de larves auprès d’un fournisseur d’appâts vivants. Bien qu’elle soit plus accessible, cette méthode augmente la complexité expérimentale et peut introduire une variabilité supplémentaire dans les essais en raison des incohérences dans la santé des larves au moment où elles sont reçues des fournisseurs. Pour que les universitaires, l’industrie et les organismes de réglementation acceptent et adoptent le test de G. mellonella dans le cadre d’un pipeline de développement préclinique d’antimicrobiens, un système normalisé d’optimisation et d’évaluation de l’efficacité antimicrobienne est nécessaire.
Cette étude optimise la conception expérimentale d’un modèle d’infection à G. mellonella pour le développement d’antibiotiques. Bien que des modèles d’infection à G. mellonella aient été décrits14,15, la méthodologie actuelle documente les étapes supplémentaires visant à atténuer la complexité supplémentaire introduite par l’incohérence de l’approvisionnement et fournit un cadre pour l’évaluation des nouveaux antimicrobiens. À titre de test, G. mellonella a été infecté par l’agent pathogène prioritaire de l’OMS, Pseudomonas aeruginosa, et le traitement par un agent aminoglycoside (tobramycine) a été optimisé. Ce cadre, illustré à la figure 1, fournit une base pour les futures études précliniques de dépistage des antimicrobiens avec de nouveaux agents.
Le fardeau de la résistance aux antimicrobiens (RAM) ne cesse d’augmenter. En 2019, on estimait à 4,95 millions le nombre de décès associés à la résistance aux antimicrobiensdans le monde. D’ici 2050, la mortalité causée par la résistance aux antimicrobiens est estimée à 10 millions31. Pour faire face à ce risque, de nouveaux antimicrobiens doivent être mis au point et testés de manière efficace et rentable, ce qui nécessite l’utilisation de modèles précliniques qui prédisent avec précision l’efficacité des antimicrobiens. Le taux d’attrition élevé observé lors de la traduction vers les essais cliniques est un facteur limitatif majeur. Une étude a décrit 13 candidats antibiotiques qui ont échoué dans les essais cliniques, dont 11 n’ont pas réussi à passer à la phase II32.
La présente étude fournit un cadre pour l’optimisation des études précliniques de dépistage antimicrobien de G. mellonella et une méthode d’évaluation de l’efficacité antimicrobienne. Les larves de G. mellonella ont une utilité considérable dans l’évaluation de la toxicité des médicaments, la détermination de la CMI et les tests de virulence, tout en contribuant à la réduction du nombre de mammifères utilisés dans le développement préclinique. Les larves de Galleria mellonella ont un débit relativement élevé, sont pertinentes sur le plan biologique et se traduisent bien dans des modèles de mammifères plus complexes. Pendant ce temps, alors que les souris de laboratoire de type sauvage coûtent entre 8 et 30 £ chacune avec ~7 £ d’entretien hebdomadaire par souris, G. mellonella coûte ~2 £ pour 50 larves. Tester 10 composés dans un modèle de G. mellonella coûterait donc ~60 £, contre plus de 4000 £ pour la même étude chez la souris. De plus, des études antérieures ont comparé la toxicité et l’efficacité de nouveaux composés et ont identifié une corrélation entre la toxicité aiguë chez G. mellonella et chez la souris 8,19,33. Par conséquent, il est recommandé de mettre en œuvre un criblage de G. mellonella pour hiérarchiser les composés à tester davantage sur des modèles murins.
Malgré l’utilité évidente du modèle, il y a plusieurs considérations pour assurer une application réussie. L’absence de larves stériles de qualité recherche complique leur préparation pour une utilisation expérimentale, car la stérilisation à l’éthanol est nécessaire, ou les chercheurs sont tenus de maintenir leur propre colonie de G. mellonella, ce qui atténuerait le risque de contamination et améliorerait la qualité globale des expériences 5,6. Une stérilisation inappropriée peut entraîner une mortalité considérable, et il est difficile de stériliser entièrement l’organisme, car un temps d’exposition plus long à l’éthanol entraîne la mort. D’autres méthodes de stérilisation comprennent l’écouvillonnage de la patte de chaque larve avec de l’éthanol à 70 % avant l’infection, ce qui réduirait la mortalité pendant la stérilisation, mais il s’agit d’une méthode plus exigeante en main-d’œuvre. D’autres antiseptiques pourraient également être utilisés, bien qu’aucune alternative n’ait été évaluée dans cette étude, car la stérilisation à l’éthanol a entraîné <10% de mortalité, une fois optimisée. De plus, il est souvent difficile de savoir si les fournisseurs traitent leur G. mellonella avec des antibiotiques, car les fournisseurs peuvent s’approvisionner en larves auprès d’autres fournisseurs plutôt que d’entretenir eux-mêmes des colonies.
La biologie de G. mellonella diffère considérablement de celle des mammifères, ce qui impose des limites à leur utilité. Leur système immunitaire n’a aucune immunité adaptative, bien que des aspects solubles et cellulaires clés de l’immunité innée soient présents. Les hémocytes sont l’une des principales défenses immunitaires innées de G. mellonella et présentent des propriétés semblables à celles des phagocytes. Différents sous-ensembles de ces cellules ont été décrits, notamment des granulocytes et des plasmatocytes, entre autres34. G. mellonella ne peut pas non plus récapituler les sites d’infection pertinents, tels que ceux des infections respiratoires ou vésicales. Cependant, dans un pipeline préclinique, G. mellonella servirait de pré-criblage aux modèles murins, garantissant que seuls les composés les plus prometteurs progresseraient jusqu’au système complexe des mammifères qui ressemble le plus aux environnements d’infection humaine. Enfin, le modèle bénéficierait d’une caractérisation génomique plus poussée de G. mellonella afin de déterminer sa pertinence pour évaluer les changements dans les biomarqueurs cliniquement pertinents. En particulier, cela nécessite d’améliorer notre compréhension de l’immunité à G. mellonella.
Dans l’ensemble, le modèle d’infection à Galleria mellonella est un outil précieux pour l’évaluation préclinique de nouveaux composés antimicrobiens avant leur évaluation dans des modèles de mammifères. Bien que leur utilisation soit compliquée par un manque de normalisation de l’approvisionnement, leur application est à haut débit, simple et peut être appliquée à grande échelle dans le paysage du développement des antimicrobiens. À l’avenir, l’intégration de ce modèle au sein d’un pipeline préclinique standardisé pourrait accélérer le développement de nouveaux composés antimicrobiens afin d’augmenter la proportion de candidats passant de l’évaluation préclinique aux essais cliniques.
The authors have nothing to disclose.
TB, AK, JF et DN ont reçu une subvention pour le Centre de recherche stratégique (CRS) « Un cadre préclinique fondé sur des données probantes pour le développement de traitements antimicrobiens dans la fibrose kystique » (PIPE-CF ; N° de projet SRC 022) du UK Cystic Fibrosis Trust et de la US Cystic Fibrosis Foundation. LD et JF reconnaissent le financement de Kidney Research North West (projet no 49/19).
22s gauge, Small Hub RN Needle, 2 in, point style 2 | Hamilton | 7758-03 | Replacement for the Hamilton syringe. |
Bacterial infection stocks | Bacterial stocks of a known density (CFU/mL) frozen during mid-exponential phase of growth. | ||
Ethanol | Fisher Scientific | 10610813 | Other manufacturers may be used. |
G. mellonella larvae | Livefoods | 5.06045E+12 | For this supplier, orders are marked as “New stock for lab use”. As of April 2024, new stock is delivered to the supplier on Mondays. Orders should be placed then, for delivery on Wednesdays. |
Microliter syringe | Hamilton | 80630 | The 80630 syringe has a 100 µL capacity. Other volumes exist, such as the 80430, 80530 or 80730. |
Petri dish | Fisher Scientific | 12674785 | Other manufacturers may be used. |