この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス に対するハイスループットスクリーニングのためのアッセイを開発し、蛍光と発光を使用して細菌の生存率を迅速に評価しました。このプロトコルは、この薬剤耐性菌に対する新薬のスクリーニングを目指す研究者に関連しています。
マイコバクテリウム膿瘍 (Mab)感染症は、多剤耐性結核に匹敵する高い内因性薬剤耐性のため、治療が困難です。治療は非常に効果がなく、多剤併用療法に基づいているため、患者のコンプライアンスは低くなります。したがって、科学界は、これらの感染症を治療するための新しく効果的な薬を特定することが求められています。この目的のために採用された戦略の1つは、ドラッグリパーパシング、つまり、市場に出回っている既存の医薬品の新しい治療機会を特定し、新薬の薬物動態および安全性プロファイルを確立するために必要な時間を回避するプロセスです。Mabに対する医薬品開発に関するほとんどの研究は、従来型で時間のかかる方法に依存しているため、マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイは、 自社 開発のMabのダブルレポーター株を使用して開発されました。リキッドハンドリングロボット、自動顕微鏡、分析、および 自社 開発のダブルレポーター株を使用して、試薬を追加したり余分な手順を実行したりすることなく、発光と蛍光の2つの異なる読み出しを使用して細菌の生存率を迅速に測定できます。これにより、アッセイ間の時間とばらつきが減り、ハイスループットスクリーニングの大きな利点となります。記載されたプロトコールは、1280化合物のライブラリーをスクリーニングすることによりバリデーションされました。得られた結果は、活性化合物の効率的な検出により、文献によって裏付けられました。したがって、この研究は、この非常に薬剤耐性のある細菌と戦うのに役立つ新しいツールをフィールドに供給するという目的を達成しました。
マイコバクテリウム・アブセッサス(Mab)は、特に嚢胞性線維症やその他の肺疾患を持つ人々の肺感染症の原因となる日和見病原体です。マブによって引き起こされる感染症は、多剤耐性結核に匹敵する絶妙な内因性薬剤耐性があるため、治療が難しいことで有名です1。利用可能な薬剤は、非常に不透過性のマイコバクテリア細胞エンベロープと、抗生物質を不活性化するいくつかの酵素をコードするゲノムのために、ほとんど効果がありません2。したがって、治療には、数か月から数年かかるいくつかの薬物の組み合わせが含まれます。この困難な多剤併用レジメンと低い患者コンプライアンスの組み合わせにより、平均治癒率は30%から50%になります3。さらに、非結核性抗酸菌によって引き起こされる肺感染症の有病率は、Mab 1,4によって引き起こされるものを含め、過去数十年にわたって増加しています。その結果、科学界はマブ感染症を治療するための新しい化合物の開発を急いでいます。
この目的で追求される戦略の1つが、ドラッグリパーパシング(既存薬の新たな治療機会を特定するプロセス)です。これにより、新薬の発見と開発のパイプラインに伴う最大の課題であるタイム5を回避できます。このシンプルなコンセプトは、いくつかの医薬品のすでに確立された薬物動態および安全性プロファイルを利用して、開発コストを削減し、医薬品をベンチからベッドサイド6まで取得するのにかかる時間を短縮します。したがって、数百から数千のそのような化合物を組み合わせたライブラリがまとめられており、研究者は目的の病原体に対して薬物を再利用する可能性を迅速にテストすることができます。
Mabに対する医薬品開発に関するほとんどの研究は、マイコバクテリアに対する化合物の in vitro 活性を評価するゴールドスタンダードでありながら伝統的なアッセイに基づいています-コロニー形成単位は7を数えます。その精度にもかかわらず、この手順は非常に時間がかかり、誰かが何千もの化合物を含むライブラリをテストすることを目指すと、すぐに実行不可能になります。この目的のために、ハイスループットスクリーニング(HTS)が医薬品開発に統合され、ロボティクスとリキッドハンドリングデバイスを活用した堅牢なアッセイにより、数千の化合物を並行して迅速にスクリーニングできるようになりました8。これは通常、96ウェル、384ウェル、1536ウェル、または3456ウェルフォーマットのマイクロタイタープレートを使用して、最初に単一の濃度をテストすることによって行われ、ヒットを特定し、それらをさらにパイプラインに最適化して臨床的に使用するための出発点として機能します。
レポーターベースのアッセイは、他の色素および吸光度ベースのアッセイ7,9と比較して、その簡便性と感度により、HTSの堅牢性に大きな利点を提供します。しかし、私たちの知る限り、Mab9に対するハイスループットスクリーニングを最適化した研究はごくわずかです。
最近、当研究室では、発光と蛍光を併発するダブルレポーター株を開発しました10。マブoperon_mScarletはそのような菌株の1つです。これは、細菌のルシフェラーゼ(luxAB遺伝子の発現による)と長鎖アルデヒド基質(luxCDE遺伝子の発現による)を含むLuxABCDEオペロンの発現により自己発光します。一方、蛍光読み出しは、最近開発された赤色蛍光タンパク質mScarletの発現によって得られ、これはより一般的に使用されるeGFPおよびmCherryタンパク質を凌駕し、より強力なシグナルを提供する11。この菌株を用いることで、試薬の追加や追加ステップを行わずに、マイクロプレートリーダーで発光シグナルを測定することで、液状培養中の細菌生存率を評価することができます。検出に関しては、固有蛍光により、色素や抗体を使用せずに、生細胞または固定細胞の顕微鏡での視覚化が可能になります。1つの株が両方の読み出しを持つことで、研究者はHTSアッセイで使用する際に大きな利点を得ることができます – 異なる読み出しを持つアッセイ間のばらつきが減少し、アッセイの性質に基づいて株を交換する必要がないためです。
したがって、この研究では、自社で設計されたダブルレポーター株を使用して、Mabに対するハイスループットアッセイを開発しました(図1)。これにより、市販のライブラリーを使用して、転用を目的としたin vitro活性1280薬剤を迅速に評価することができました(資料表を参照)。第一に、活性は発光性を用いたブロス培養アッセイで評価され、第二に、蛍光シグナルを利用してMabに感染したマクロファージを使用することにより、in vivoで見られる感染プロセスをよりよくエミュレートした12。
図1:確立されたプロトコルのグラフィカルな要約。 このスクリーニングの主役は、 自社開発の ダブルレポーターマイコバクテリア株であり、すべての実験で使用されています。まず、試薬ディスペンサーとプランクトン性細菌を使用して、化合物を単一濃度で試験することにより、初期スクリーニングを行います。同定されたヒットはバリデーションアッセイに進み、3つの異なる濃度が試験されます。どちらの実験も発光読み出しを使用して行われます。検証されたヒットは感染アッセイに進み、3つの異なる濃度もテストされ、骨髄由来マクロファージがMOI 1で感染します。ハイコンテントイメージングシステムが細菌の蛍光シグナルを取得し、解析ソフトウェアを使用してMycoloadフォーミュラによる細胞内負荷を評価します。アッセイの複雑さが増すと、化合物の数は減少します。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このプロトコルは、 自社開発株10におけるMabに対する薬物スクリーニングパイプラインについて記述している。リキッドハンドリングロボット、自動顕微鏡検査と分析、およびダブルレポーター株を使用して、試薬を追加したり余分な手順を実行したりすることなく、発光または蛍光を使用して細菌の生存率を迅速に評価します。このアプローチにより、アッセイ間の時間とばらつきが減り、HTSアッセイの目的を考える上で大きな利点となります。
何千もの化合物をスクリーニングする場合、効果的な薬剤を簡単に特定する必要があります。この目的のために、Z’因子は、アッセイの性能を推測する統計的効果サイズを測定するためによく使用されます。Z’因子が0.5>場合、試験条件は、処理された集団と未処理の集団を区別するのに最適である13。試験した条件では、Z’因子>0.6(図2)が得られ、スクリーニングキャンペーンに適用できることが統計的に証明されました。このステップは、スクリーニングの有効性を確保するために重要です。
そこで、浮遊性に増殖するMabに対する数千種類の化合物の抗菌活性を検出するためのHTSプロトコルが開発されました。Mabは細胞内通性病原体であるため、設計されたプロトコルは、同じ細菌株に対する細胞内抗菌活性もスクリーニングします-これは重要な利点です。さらに、宿主細胞に対する毒性も評価できます。したがって、Mab に対する薬物スクリーニングへの多段階のアプローチが説明されており、さまざまな実験設定を使用して抗菌活性と細胞毒性を評価し、成功の可能性を高めます。概念実証として、1280の化合物からなる化学ライブラリーをスクリーニングしました。
合計33のヒットが特定されました(図3)。そのうち、3つは液体培養におけるマイコバクテリアの生存率を有意に増加させました(化合物30、31、および32;図 3 と図 4)。これらの化合物は、細菌の生存率に影響を与えることなく発光発光を妨害する可能性があることに注意する必要があります。内在化マイコバクテリアに対して試験したところ、これらの化合物は抗菌活性を示し(図6)、宿主細胞の内在化後にMabに対してより高い有効性を示しました。これらの化合物は、トロレアンドマイシン(30)、スピラマイシン(32)、およびリンコマイシン(31;表 1)。前者の2つは、マイコバクテリア感染症の治療に使用される抗生物質の一種であるマクロライド16であり、後者は、マクロライド17と同様の作用機序を持つ抗生物質であるリンコサミドである。マブは、液体および固体の培養物の両方で、別のリンコサミドであるクリンダマイシンに対して特に耐性があることが報告されています18。それにもかかわらず、免疫調節および抗炎症特性はマクロライド19,20およびリンコサミド21と関連しており、これは、内在化マイコバクテリアに対する抗菌活性の増加を説明する可能性があります(図6)。
残りの30回のヒットのうち、11回のヒットは、すべての濃度でマイコバクテリアの生存率を>90%低下させます(図4)。一般的なHTSアッセイの予想ヒット率が~1%22であることを考えると、開発されたプロトコルは通常観察されるものと一致しています。それにもかかわらず、他のいくつかの化合物はまだ活性があり、28の化合物が感染アッセイに進みました。
同定された化合物のうち、ダウノルビシン(4)、ドキソルビシン(5)、エピルビシン(27)、チオストレプトン(6)、およびパモ酸ピルビニウム(28;表 1)。最初の3つは抗腫瘍剤23,24,25であるため、当然のことながら、このアッセイで使用される哺乳動物細胞に対して毒性があります。パモ酸ピルビニウムは、効果的な駆虫薬として長年使用されてきました。しかし、2004年以降、それは反腫瘍活動とも関連している26。最後に、チオストレプトンは獣医学でよく使用されるオリゴペプチドであり、ヒトでの使用は承認されていません27。乳がん細胞に対するこの薬剤の活性は報告されています28。チオストレプトンのマクロファジー内活性は、骨髄由来マクロファージに対する毒性のため評価されませんでした(図5)。しかし、チオストレプトンはMabに感染したTHP-1細胞に対して5μMで有効であることが示されている29。プランクトン性細菌29に対する報告された結果は、このスクリーニングで得られた結果と同様であり、チオストレプトンは非常に強力です(図4)。
マクロファジー内活性についてスクリーニングされたほとんどの化合物は、治療の可能性を示さなかった(図6)。細菌の細胞内増殖は、プランクトン培養とは大きく異なります。後者では、細菌と薬物との直接接触が常に可能です。前者では、宿主細胞による内在化により、いくつかの宿主膜が、薬物が標的に到達するために転置する必要がある物理的な障壁として機能し、ほとんどのヒットの抗菌活性の低下を説明するのに役立ちます。最高濃度の13.3μMでは、セフジニル(21)、ガチフロキサシン(26)、モキシフロキサシン(29;表 1)。モキシフロキサシンはすでに第二選択の抗結核薬として使用されていますが16、セフジニルは肺炎30などのいくつかの気道細菌感染症の治療に一般的に使用されています。しかし、結核菌31およびマブに対するその活性が報告されており、後者32に対するカルバペネムとの強力な相乗効果を示しています。ガチフロキサシンはフルオロキノロンであり、その活性は過去33,34にいくつかのマイコバクテリアに対して報告されています。このアッセイで最も活性の高い3つの化合物(図6)は、ロキシスロマイシン(17)、クラリスロマイシン(22)、およびリファブチン(25;表1)は、すべての濃度で非常に強力です。最初の2つはマクロライド類であるのに対し、リファブチンはリファマイシンであり、両方のクラスが多くのマイコバクテリア感染症に対する治療の基礎として機能しています16。
このスクリーニングは、アッセイ間のばらつきを減らすために、特定の高価なリキッドハンドリング装置に依存しています。非常に再現性が高いにもかかわらず、リキッドハンドラーには、音響的なもののような化合物の非接触転写がありません。したがって、特定の付着性化合物は、転写間で金属ピンに付着したままになり、後続のウェルに持ち越され、スクリーニング段階で偽陽性が発生する可能性があります-これが化合物33で起こったことでした。そのため、スクリーニングの検証は、その成功にとって非常に重要であり、偽陽性が薬物スクリーニングパイプラインの次のステップに進むことがないようにします。感染アッセイでは、共焦点モードを備えたハイコンテントイメージングシステムを使用して、細菌領域の可能な限り最高の定義を取得します。それにもかかわらず、共焦点モードなしで使用することは可能ですが、定義が失われ、細菌領域の同定が妨げられる可能性があります。このプロトコルは、イメージングシステムに統合されたシンプルでユーザーフレンドリーな解析ソフトウェアを利用しています。ただし、オープンソースソフトウェアはプロトコルに従って使用できます(補足図5)。結局のところ、マブ感染症の治療に薬剤を転用していないにもかかわらず、これらの結果は確立されたプロトコルを検証し、より大きなライブラリーに拡張できるため、非常に重要です。重要なことは、このプロトコルは、蛍光または発光性の測定値が利用可能であれば、あらゆる細菌に適応できると私たちは信じています。このように、この研究は創薬分野に大きく貢献し、最大の公衆衛生問題の1つである抗生物質耐性菌、特にほとんど難治性の病原体であるマイコバクテリウム・アブセッサスと戦うために必要なツールを提供しています。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、プロジェクトPTDC/BIA-MIC/3458/2020(DOI:10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020)およびGSOおよびUI/BD/150830/2021からCMBに 2021.07335.BD された博士課程フェローシップ内のFCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia、I.Pを通じてポルトガルの国家資金によって資金提供されています。FWO – フランダース研究財団、助成金番号1S68720N;Innovative Medicine Initiative 2 Call 16 (IMI2-Call 16) 提案 RespiriTB 契約番号 853903.著者らは、国家インフラPT-OPENSCREEN(NORTE-01-0145-FEDER-085468)およびPPBI-ポルトガルバイオイメージングプラットフォーム(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)のメンバーであるi3S Scientific Platform BioSciences Screeningの支援に感謝します。
10% Neutral buffered formalin | Bio Optica | 05-01005Q | fixation solution |
384-well black round bottom polypropylene not treated microplate | Corning | 3658 | White microplates can be used; polystyrene can be used |
50 TS Washer | BioTek | ||
Breathe-Easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
cell::explorer | Revvity | equipment handling robot | |
Clarithromycin | Sigma-Aldrich | A3487-100MG | Dissolved in DMSO to the desired concentration |
DMSO | Fisher Scientific | D/4121/PB15 | Dilute in liquid growth medium to the desired concentration |
Harmony 5.1 | Revvity | analysis software | |
Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | cell incubator | |
JANUS with 4 Tip Arm and MDT Arm | Revvity | liquid handler | |
KB 8182 | Termaks | incubator with agitation | |
Libra S4+ | Biochrom | ||
Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | ||
Opera Phenix Plus | Revvity | imaging system | |
PhenoPlate | Revvity | 6055302 | Necessary for high-content microscopes |
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x | NA | NA | washing solution |
Prestwick Chemical libraries | Commercial chemical library intended for drug repurposing | ||
Shaking incubator 3031 | GFL | ||
VICTOR Nivo | Revvity | ||
Cell culture medium: | When needed, add 10% of supplement | ||
DMEM | Gibco | 10938-025 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Gibco | 15630-056 | |
LCCM | NA | NA | Conditioned media from L929 cell line that releases Macrophage colony stimulating factor (M-CSF); cell culture medium supplement |
L-glutamin (200 mM) | Thermo Scientific | 25030024 | |
Sodium Pyruvate 100 mM (100X) | Gibco | 11360-039 | |
Infection washing solution | |||
Apirogenic water | Multiple suppliers available | ||
Hank's Balanced Salt Solution 10x | Gibco | 14060-040 | Dilute to 1x with apirogenic water |
Permeabilising Solution | PBS with 0.1% Triton X100 | ||
PBS 1x | NA | NA | |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Other suppliers available |
Staining solution | PBS with DAPI (500 ng/mL) and HCS Far Red (10 ng/mL) | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
HCS Far Red | Invitrogen | H32721 | |
PBS 1x | NA | NA | Multiple suppliers available |
Liquid growth medium | When needed, add 10% supplement | ||
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich | P4780 | 0.05% final concentration. Other suppliers available |
Liquid growth medium supplement: | |||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9702-100 | |
D-Glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 |