Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.
Les infections à Mycobacterium abscessus (Mab) sont difficiles à traiter en raison de leur forte résistance intrinsèque aux médicaments, comparable à celle de la tuberculose multirésistante. Les traitements sont extrêmement inefficaces et basés sur un régime multimédicamenteux, ce qui entraîne une faible observance des patients. Par conséquent, la communauté scientifique est invitée à identifier de nouveaux médicaments efficaces pour traiter ces infections. L’une des stratégies employées à cette fin est la réorientation des médicaments, c’est-à-dire le processus d’identification de nouvelles opportunités thérapeutiques pour les médicaments existants sur le marché, en contournant le temps nécessaire à l’établissement des profils pharmacocinétiques et d’innocuité des nouveaux médicaments. La plupart des études sur le développement de médicaments contre Mab reposant sur des méthodes traditionnelles et chronophages, un test de criblage de médicaments à haut débit a été mis au point contre les mycobactéries à l’aide d’une souche à double rapporteur de Mab développée en interne. À l’aide de la robotique de manipulation des liquides, de la microscopie automatisée et de l’analyse, ainsi que de souches à double rapporteur développées en interne, la viabilité bactérienne peut être rapidement mesurée à l’aide de deux lectures différentes, la luminescence et la fluorescence, sans ajouter de réactifs ni effectuer d’étapes supplémentaires. Cela réduit le temps et la variabilité entre les essais, un avantage majeur pour les criblages à haut débit. Le protocole décrit a été validé par le criblage d’une bibliothèque de 1280 composés. Les résultats obtenus ont été corroborés par la littérature, avec une détection efficace des composés actifs. Ainsi, ces travaux ont atteint l’objectif de doter le domaine d’un nouvel outil pour aider à lutter contre cette bactérie extrêmement résistante aux médicaments.
Mycobacterium abscessus (Mab) est un agent pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires, en particulier chez les personnes atteintes de mucoviscidose et d’autres troubles pulmonaires. Les infections causées par l’épi mab sont tristement difficiles à traiter en raison de leur résistance intrinsèque aux médicaments, comparable à celle de la tuberculose multirésistante1. Les médicaments disponibles sont largement inefficaces en raison de l’enveloppe cellulaire mycobactérienne hautement imperméable et d’un génome qui code pour plusieurs enzymes qui désactivent les antibiotiques2. Ainsi, le traitement comprend la combinaison de plusieurs médicaments prenant des mois à des années. Ce schéma thérapeutique multimédicamenteux complexe, combiné à une faible observance du patient, se traduit par un taux de guérison moyen de 30 % à 50 %3. De plus, la prévalence des infections pulmonaires causées par des mycobactéries non tuberculeuses a augmenté au cours des dernières décennies, y compris celles causées par Mab 1,4. Par conséquent, la communauté scientifique s’efforce de développer de nouveaux composés pour traiter les infections à Mab.
L’une des stratégies poursuivies dans ce but est la réaffectation des médicaments, c’est-à-dire le processus d’identification de nouvelles opportunités thérapeutiques pour les médicaments existants. Cela permet de contourner le plus grand défi accompagnant le pipeline de découverte et de développement d’un nouveau médicament – temps5. Ce concept simple tire parti des profils pharmacocinétiques et d’innocuité déjà établis de plusieurs médicaments pour réduire les coûts de développement et raccourcir le délai nécessaire pour acheminer un médicament du laboratoire au chevet du patient6. Ainsi, des banques qui combinent des centaines à des milliers de ces composés ont été compilées, ce qui permet aux chercheurs de tester rapidement la possibilité de réorienter les médicaments contre leur agent pathogène d’intérêt.
La plupart des études sur le développement de médicaments contre le Mab sont basées sur un test traditionnel de référence qui évalue l’activité in vitro d’un composé contre les mycobactéries – les unités formant des colonies comptant7. Malgré sa précision, cette procédure prend énormément de temps, devenant rapidement irréalisable lorsque quelqu’un vise à tester des banques contenant des milliers de composés. À cette fin, les criblages à haut débit (HTS) ont été intégrés dans le développement de médicaments – des tests robustes qui tirent parti de la robotique et des dispositifs de manipulation des liquides, permettant à des milliers de composés d’être rapidement criblés en parallèle8. Cela se fait généralement en testant initialement une seule concentration, à l’aide de plaques de microtitration de formats 96, 384, 1536 ou 3456 puits, servant de point de départ pour identifier les résultats et les optimiser davantage en cours de développement pour être utilisés cliniquement.
Les dosages basés sur le rapporteur offrent un avantage significatif pour la robustesse des SHD en raison de leur simplicité et de leur sensibilité par rapport à d’autres dosages basés sur les colorants et l’absorbance 7,9. Cependant, à notre connaissance, seules quelques études ont permis d’optimiser un dépistage à haut débit contre Mab9.
Récemment, notre laboratoire a mis au point des souches à double rapporteur capables d’émettre simultanément une luminescence et une fluorescence10. Mab operon_mScarlet est l’une de ces souches. Il est autoluminescent en raison de l’expression de l’opéron LuxABCDE , qui comprend une luciférase bactérienne (par expression des gènes luxAB ) et un substrat aldéhyde à longue chaîne (par expression des gènes luxCDE ). D’autre part, la lecture fluorescente est obtenue par l’expression d’une protéine fluorescente rouge récemment développée, mScarlet, qui surpasse les protéines eGFP et mCherry plus couramment utilisées, fournissant un signal plus puissant11. L’utilisation de cette souche nous permet d’évaluer la viabilité bactérienne en culture liquide en mesurant le signal luminescent dans un lecteur de microplaques sans ajouter de réactifs ni effectuer d’étapes supplémentaires. En termes de détection, la fluorescence intrinsèque permet une visualisation au microscope dans des cellules vivantes ou fixes sans utiliser de colorants ou d’anticorps. Le fait d’avoir une seule souche avec les deux lectures offre aux chercheurs un avantage significatif lorsqu’ils l’utilisent dans les tests HTS – la variabilité réduite entre les tests avec des lectures différentes, car il n’est pas nécessaire d’échanger les souches en fonction de la nature du test.
Ainsi, ce travail a mis au point un test à haut débit contre Mab à l’aide d’une souche double rapporteure conçue en interne (Figure 1). Cela a permis d’évaluer rapidement l’activité in vitro des médicaments 1280 destinés à être repositionnés à l’aide d’une bibliothèque commerciale (voir la table des matériaux). Tout d’abord, les activités ont été évaluées dans un essai de culture en bouillon utilisant la luminescence, et deuxièmement, en utilisant des macrophages infectés par Mab tirant parti du signal fluorescent, imitant mieux le processus d’infection observé in vivo12.
Figure 1 : Résumé graphique du protocole établi. L’acteur clé de ce criblage est une souche mycobactérienne à double rapporteur développée en interne, qui est utilisée dans toutes les expériences. Tout d’abord, à l’aide d’un distributeur de réactifs et de bactéries planctoniques, un premier criblage est effectué en testant les composés à une concentration unique. Les résultats positifs identifiés se poursuivent lors de l’essai de validation, où trois concentrations différentes sont testées. Les deux expériences sont réalisées à l’aide de la lecture luminescente. Les résultats validés se poursuivent dans le test d’infection, où trois concentrations différentes sont également testées, et où des macrophages dérivés de la moelle osseuse sont infectés au MOI 1. Un système d’imagerie à haut contenu acquiert le signal fluorescent bactérien, et un logiciel d’analyse est utilisé pour évaluer la charge intracellulaire à l’aide de la formule de la mycocharge. Le nombre de composés diminue à mesure que la complexité du test augmente. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ce protocole décrit un pipeline de dépistage de médicaments contre le Mab à l’aide de souches 10 développées en interne. À l’aide de la robotique de manipulation des liquides, de la microscopie et de l’analyse automatisées et des souches à double rapporteur, la viabilité bactérienne est rapidement évaluée à l’aide de la luminescence ou de la fluorescence sans ajouter de réactifs ni effectuer d’étapes supplémentaires. Cette approche réduit le temps et la variabilité entre les essais, ce qui est un avantage significatif si l’on considère l’objectif des tests HTS.
Lors du criblage de milliers de composés, un médicament efficace doit être facilement identifié. À cette fin, le facteur Z’ est souvent utilisé pour mesurer la taille de l’effet statistique, en déduisant les performances du test. Si le facteur Z > de 0,5, les conditions testées sont optimales pour distinguer les populations traitées des populations non traitées13. Les conditions testées ont donné des facteurs Z > 0,6 (figure 2), prouvant statistiquement qu’ils pouvaient être appliqués à une campagne de dépistage. Cette étape est cruciale pour garantir l’efficacité du dépistage.
Ainsi, un protocole HTS a été développé pour détecter l’activité antimicrobienne de milliers de composés contre le Mab en croissance planctonique. Comme le Mab est un agent pathogène facultatif intracellulaire, le protocole conçu permet également de cribler l’activité antimicrobienne intracellulaire contre la même souche bactérienne – un avantage essentiel. De plus, la toxicité envers les cellules hôtes peut également être évaluée. Ainsi, une approche en plusieurs étapes du criblage des médicaments contre le Mab est décrite, en utilisant différents dispositifs expérimentaux pour évaluer l’activité antimicrobienne ainsi que la cytotoxicité, augmentant ainsi les chances de succès. En guise de preuve de concept, une chimiothèque comprenant 1280 composés a été criblée.
Au total, trente-trois résultats positifs ont été recensés (figure 3). Parmi ceux-ci, trois ont considérablement augmenté la viabilité mycobactérienne dans les cultures liquides (composés 30, 31 et 32 ; Figure 3 et Figure 4). Il convient de noter que ces composés peuvent interférer avec l’émission de luminescence sans affecter la viabilité bactérienne. Lorsqu’ils ont été testés contre des mycobactéries internalisées, ces composés ont montré une activité antimicrobienne (Figure 6), démontrant une efficacité plus élevée contre les Mab après l’internalisation de la cellule hôte. Ces composés ont été identifiés comme étant la troleandomycine (30), la spiramycine (32) et la lincomycine (31 ; Tableau 1). Les deux premiers sont des macrolides, une classe d’antibiotiques utilisés pour traiter les infections mycobactériennes16, et le second est un lincosamide, un antibiotique dont le mécanisme d’action est similaire à celui des macrolides17. Il a été signalé que Mab est particulièrement résistant à un autre lincosamide, la clindamycine, dans les cultures liquides et solides18. Néanmoins, des propriétés immunomodulatrices et anti-inflammatoires ont été associées aux macrolides19,20 et aux lincosamides21, ce qui pourrait expliquer l’augmentation de l’activité antimicrobienne contre les mycobactéries internalisées (Figure 6).
Sur les trente occurrences restantes, onze réduisent de >90 % la viabilité mycobactérienne à toutes les concentrations (figure 4). Étant donné qu’un test HTS typique a un taux de réussite attendu de ~1%22, le protocole développé est en accord avec ce qui est généralement observé. Néanmoins, plusieurs autres composés étaient encore actifs, et vingt-huit ont poursuivi le test d’infection.
Parmi les composés identifiés, cinq ont été jugés toxiques (figure 5) : la daunorubicine (4), la doxorubicine (5), l’épirubicine (27), le thiostrepton (6) et le pamoate de pyrvinium (28 ; Tableau 1). Les trois premiers sont des agents antinéoplasiques 23,24,25, donc sans surprise, ils sont toxiques pour les cellules de mammifères utilisées dans cet essai. Le pamoate de pyrvinium a été utilisé pendant de nombreuses années comme anthelminthique efficace ; Cependant, depuis 2004, il a également été associé à des activités antinéoplasiques26. Enfin, le thiostrepton est un oligopeptide souvent utilisé en médecine vétérinaire, jamais approuvé pour une utilisation chez l’homme27. L’activité de ce médicament contre les cellules cancéreuses du sein a été rapportée28. L’activité intramacrophagique du thiostrepton n’a pas été évaluée en raison de sa toxicité sur les macrophages dérivés de la moelle osseuse (figure 5). Cependant, il a été démontré que le thiostrepton est efficace à 5 μM sur les cellules THP-129 infectées par Mab. Les résultats rapportés contre les bactéries planctoniques29 sont similaires à ceux obtenus dans ce dépistage, le thiostrepton étant extrêmement puissant (Figure 4).
La plupart des composés dont l’activité intramacrophagique a été testée n’ont montré aucun potentiel thérapeutique (Figure 6). La croissance intracellulaire bactérienne est considérablement différente de celle des cultures planctoniques. Dans ce dernier, un contact direct entre les bactéries et les médicaments est toujours possible. Dans le premier cas, en raison de l’internalisation par les cellules hôtes, plusieurs membranes de l’hôte agissent comme des barrières physiques que les médicaments doivent transposer pour atteindre la cible, ce qui peut aider à expliquer la diminution de l’activité antimicrobienne de la plupart des hits. À la concentration la plus élevée, soit 13,3 μM, trois composés présentaient une puissance suffisante pour être statistiquement différents du témoin DMSO (figure 6) : le cefdinir (21), la gatifloxacine (26) et la moxifloxacine (29 ; Tableau 1). Alors que la moxifloxacine est déjà utilisée comme médicament antituberculeux de deuxième intention16, le cefdinir est couramment utilisé pour traiter plusieurs infections bactériennes des voies respiratoires, telles que la pneumonie30. Cependant, son activité contre M. tuberculosis31 et Mab a été signalée, montrant un puissant effet synergique avec un carbapénème contre ce dernier32. La gatifloxacine est une fluoroquinolone, et son activité a été signalée contre plusieurs mycobactéries dans le passé33,34. Les trois composés les plus actifs de cet essai (figure 6) étaient la roxithromycine (17), la clarithromycine (22) et la rifabutine (25 ; Tableau 1), qui sont extrêmement puissants à toutes les concentrations. Les deux premiers sont des macrolides, tandis que la rifabutine est une rifamycine, les deux classes servant de base au traitement contre de nombreuses infections mycobactériennes16.
Ce criblage s’appuie sur un équipement de manipulation de liquides spécifique et coûteux pour réduire la variabilité entre les dosages. Bien qu’il soit extrêmement reproductible, le manipulateur de liquides ne dispose pas d’un transfert sans contact de composés, comme un transfert acoustique. Ainsi, certains composés adhérents peuvent rester attachés aux broches métalliques entre les transferts, se répercutant sur les puits suivants, entraînant des faux positifs pendant la phase de criblage – c’est ce qui s’est passé avec le composé 33. C’est pourquoi la validation du dépistage est si essentielle à son succès, car elle permet de s’assurer qu’aucun faux positif ne se poursuit aux étapes suivantes du processus de dépistage des médicaments. Le test d’infection utilise un système d’imagerie à haut contenu avec un mode confocal pour obtenir la meilleure définition possible des régions bactériennes. Néanmoins, il est toujours possible de l’utiliser sans mode confocal, bien qu’avec une perte de définition et éventuellement un obstacle à l’identification des régions bactériennes. Ce protocole tire parti du logiciel d’analyse simple et convivial intégré au système d’imagerie ; cependant, des logiciels open source peuvent être utilisés selon le protocole (Figure supplémentaire 5). En fin de compte, bien qu’il n’y ait pas de réorientation des médicaments pour traiter les infections à Mab, ces résultats sont extrêmement importants car ils valident le protocole établi, qui peut être étendu à de plus grandes bibliothèques. Il est important de noter que nous pensons que ce protocole peut être adapté à n’importe quelle bactérie, à condition que des lectures fluorescentes ou luminescentes soient disponibles. Ainsi, ce travail contribue de manière significative au domaine de la découverte de médicaments, en fournissant les outils nécessaires pour aider à lutter contre l’un des plus grands problèmes de santé publique – les bactéries résistantes aux antibiotiques – et en particulier un agent pathogène presque intraitable – Mycobacterium abscessus.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est financé par des fonds nationaux portugais par l’intermédiaire de FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P, dans le cadre du projet PTDC/BIA-MIC/3458/2020 (DOI : 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020) et des bourses de doctorat 2021.07335.BD à GSO et UI/BD/150830/2021 à CMB ; FWO – Fondation pour la recherche Flandre, subvention n° 1S68720N ; Innovative Medicine Initiative 2 Call 16 (IMI2-Call 16) proposition RespiriTB sous le numéro d’accord 853903. Les auteurs remercient le soutien de la Plateforme Scientifique i3S BioSciences Screening, membre des infrastructures nationales PT-OPENSCREEN (NORTE-01-0145-FEDER-085468) et PPBI – Plateforme Portugaise de Bioimagerie (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122).
10% Neutral buffered formalin | Bio Optica | 05-01005Q | fixation solution |
384-well black round bottom polypropylene not treated microplate | Corning | 3658 | White microplates can be used; polystyrene can be used |
50 TS Washer | BioTek | ||
Breathe-Easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
cell::explorer | Revvity | equipment handling robot | |
Clarithromycin | Sigma-Aldrich | A3487-100MG | Dissolved in DMSO to the desired concentration |
DMSO | Fisher Scientific | D/4121/PB15 | Dilute in liquid growth medium to the desired concentration |
Harmony 5.1 | Revvity | analysis software | |
Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | cell incubator | |
JANUS with 4 Tip Arm and MDT Arm | Revvity | liquid handler | |
KB 8182 | Termaks | incubator with agitation | |
Libra S4+ | Biochrom | ||
Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | ||
Opera Phenix Plus | Revvity | imaging system | |
PhenoPlate | Revvity | 6055302 | Necessary for high-content microscopes |
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x | NA | NA | washing solution |
Prestwick Chemical libraries | Commercial chemical library intended for drug repurposing | ||
Shaking incubator 3031 | GFL | ||
VICTOR Nivo | Revvity | ||
Cell culture medium: | When needed, add 10% of supplement | ||
DMEM | Gibco | 10938-025 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Gibco | 15630-056 | |
LCCM | NA | NA | Conditioned media from L929 cell line that releases Macrophage colony stimulating factor (M-CSF); cell culture medium supplement |
L-glutamin (200 mM) | Thermo Scientific | 25030024 | |
Sodium Pyruvate 100 mM (100X) | Gibco | 11360-039 | |
Infection washing solution | |||
Apirogenic water | Multiple suppliers available | ||
Hank's Balanced Salt Solution 10x | Gibco | 14060-040 | Dilute to 1x with apirogenic water |
Permeabilising Solution | PBS with 0.1% Triton X100 | ||
PBS 1x | NA | NA | |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Other suppliers available |
Staining solution | PBS with DAPI (500 ng/mL) and HCS Far Red (10 ng/mL) | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
HCS Far Red | Invitrogen | H32721 | |
PBS 1x | NA | NA | Multiple suppliers available |
Liquid growth medium | When needed, add 10% supplement | ||
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich | P4780 | 0.05% final concentration. Other suppliers available |
Liquid growth medium supplement: | |||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9702-100 | |
D-Glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 |