In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.
Mycobacterium abscessus (Mab)-Infektionen sind aufgrund der hohen intrinsischen Arzneimittelresistenz, vergleichbar mit der multiresistenten Tuberkulose, schwierig zu behandeln. Die Behandlungen sind äußerst unwirksam und basieren auf einem Multi-Drug-Regime, was zu einer geringen Compliance der Patienten führt. Daher ist die wissenschaftliche Gemeinschaft aufgefordert, neue und wirksame Medikamente zur Behandlung dieser Infektionen zu identifizieren. Eine der Strategien, die zu diesem Zweck eingesetzt werden, ist das Drug Repurposing – der Prozess der Identifizierung neuer therapeutischer Möglichkeiten für bestehende Medikamente auf dem Markt, um die Zeit zu umgehen, die für die Erstellung von pharmakokinetischen und Sicherheitsprofilen neuer Medikamente erforderlich ist. Da die meisten Studien zur Arzneimittelentwicklung gegen Mab auf traditionellen und zeitaufwändigen Methoden beruhen, wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien unter Verwendung eines selbst entwickelten Doppelreporterstamms von Mab entwickelt. Mithilfe von Liquid-Handling-Robotik, automatisierter Mikroskopie und Analyse sowie intern entwickelten Doppelreporterstämmen kann die Lebensfähigkeit von Bakterien mit zwei verschiedenen Messwerten, Lumineszenz und Fluoreszenz, schnell gemessen werden, ohne dass Reagenzien hinzugefügt oder zusätzliche Schritte durchgeführt werden müssen. Dies reduziert den Zeitaufwand und die Variabilität zwischen den Assays, ein großer Vorteil für Hochdurchsatz-Screenings. Das beschriebene Protokoll wurde durch das Screening einer Bibliothek von 1280 Verbindungen validiert. Die erzielten Ergebnisse wurden durch die Literatur bestätigt, wobei die Wirkstoffe effizient nachgewiesen werden konnten. Damit wurde mit dieser Arbeit das Ziel erfüllt, dem Feld ein neues Werkzeug zur Verfügung zu stellen, das bei der Bekämpfung dieser extrem arzneimittelresistenten Bakterien hilft.
Mycobacterium abscessus (Mab) ist ein opportunistischer Erreger, der für Lungeninfektionen verantwortlich ist, insbesondere bei Menschen mit Mukoviszidose und anderen Lungenerkrankungen. Infektionen, die durch Mab verursacht werden, sind aufgrund ihrer exquisiten intrinsischen Arzneimittelresistenz, vergleichbar mit der multiresistenten Tuberkulose, berüchtigt schwierig zu behandeln1. Die verfügbaren Medikamente sind aufgrund der hochundurchlässigen mykobakteriellen Zellhülle und eines Genoms, das für mehrere Enzyme kodiert, die Antibiotika deaktivieren, weitgehend wirkungslos2. So umfasst die Behandlung die Kombination mehrerer Medikamente, die Monate bis Jahre dauert. Dieses anspruchsvolle Multi-Drug-Schema in Kombination mit der geringen Compliance der Patienten führt zu einer durchschnittlichen Heilungsrate von 30 % bis 50 %3. Darüber hinaus hat die Prävalenz von Lungeninfektionen, die durch nicht-tuberkulöse Mykobakterien verursacht werden, in den letzten Jahrzehnten zugenommen, einschließlich derjenigen, die durch Mabverursacht werden 1,4. Daher arbeitet die wissenschaftliche Gemeinschaft an einem Wettlauf um die Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung von Mab-Infektionen.
Eine der Strategien, die zu diesem Zweck verfolgt werden, ist das Drug Repurposing – der Prozess der Identifizierung neuer therapeutischer Möglichkeiten für bestehende Medikamente. Dadurch wird die größte Herausforderung umgangen, die mit der Entdeckungs- und Entwicklungspipeline eines neuen Medikaments einhergeht – Zeit5. Dieses einfache Konzept nutzt die bereits etablierten pharmakokinetischen und Sicherheitsprofile mehrerer Medikamente, um die Entwicklungskosten zu senken und die Zeitspanne zu verkürzen, die benötigt wird, um ein Medikament vom Labortisch bis zum Krankenbett zu bringen6. So wurden Bibliotheken zusammengestellt, die Hunderte bis Tausende solcher Verbindungen kombinieren, die es den Forschern ermöglichen, schnell die Möglichkeit der Wiederverwendung von Medikamenten gegen ihren Erreger von Interesse zu testen.
Die meisten Studien zur Arzneimittelentwicklung gegen Mab basieren auf einem Goldstandard, der die In-vitro-Aktivität eines Wirkstoffs gegen Mykobakterien bewertet – koloniebildende Einheiten, die7 zählen. Trotz seiner Genauigkeit ist dieses Verfahren extrem zeitaufwändig und wird schnell undurchführbar, wenn jemand Bibliotheken mit Tausenden von Verbindungen testen möchte. Zu diesem Zweck wurden Hochdurchsatz-Screenings (HTS) in die Arzneimittelentwicklung integriert – robuste Assays, die die Vorteile von Robotik und Liquid-Handling-Geräten nutzen und es ermöglichen, Tausende von Verbindungen schnell parallel zu screenen8. Dies geschieht in der Regel durch das Testen einer einzelnen Konzentration zunächst unter Verwendung von Mikrotiterplatten in den Formaten 96, 384, 1536 oder 3456 Wells, die als Ausgangspunkt für die Identifizierung von Treffern und deren weitere Optimierung in der Pipeline für den klinischen Einsatz dienen.
Reporterbasierte Assays bieten aufgrund ihrer Einfachheit und Sensitivität im Vergleich zu anderen farbstoff- und absorptionsbasierten Assays einen signifikanten Vorteil für die Robustheit von HTS 7,9. Unseres Wissens nach haben jedoch nur wenige Studien ein Hochdurchsatz-Screening gegen Mab9 optimiert.
Vor kurzem hat unser Labor Doppelreporterstämme entwickelt, die in der Lage sind, gleichzeitig Lumineszenz und Fluoreszenz10 zu emittieren. Mab operon_mScarlet ist eine dieser Sorten. Es ist autolumineszierend aufgrund der Expression des LuxABCDE-Operons , das eine bakterielle Luciferase (durch Expression der luxAB-Gene ) und ein langkettiges Aldehydsubstrat (durch Expression der luxCDE-Gene ) umfasst. Auf der anderen Seite wird die Fluoreszenzauslesung durch die Expression eines kürzlich entwickelten rot fluoreszierenden Proteins, mScarlet, erreicht, das die typischerweise verwendeten eGFP- und mCherry-Proteine übertrifft und ein stärkeres Signal liefert11. Die Verwendung dieses Stammes ermöglicht es uns, die Lebensfähigkeit von Bakterien in Flüssigkulturen zu beurteilen, indem wir das Lumineszenzsignal in einem Mikroplatten-Reader messen, ohne Reagenzien hinzuzufügen oder zusätzliche Schritte durchzuführen. Was die Detektion betrifft, so ermöglicht die intrinsische Fluoreszenz die mikroskopische Visualisierung in lebenden oder fixierten Zellen ohne den Einsatz von Farbstoffen oder Antikörpern. Die Tatsache, dass ein einziger Stamm mit beiden Messwerten vorhanden ist, bietet Forschern einen erheblichen Vorteil bei der Verwendung in HTS-Assays – die geringere Variabilität zwischen Assays mit unterschiedlichen Messwerten, da es nicht erforderlich ist, Stämme basierend auf der Art des Assays auszutauschen.
Daher wurde in dieser Arbeit ein Hochdurchsatz-Assay gegen Mab unter Verwendung eines selbst entwickelten Doppelreporterstamms entwickelt (Abbildung 1). Dies ermöglichte eine schnelle Bewertung der In-vitro-Aktivität 1280 Arzneimittel, die für die Wiederverwendung bestimmt waren, mit Hilfe einer kommerziellen Bibliothek (siehe Materialtabelle). Zum einen wurden die Aktivitäten in einem Bouillonkultur-Assay mittels Lumineszenz bewertet, zum anderen durch die Verwendung von Mab-infizierten Makrophagen, die sich das Fluoreszenzsignal zunutze machten, um den in vivo beobachteten Infektionsprozess besser zu emulieren 12.
Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung des etablierten Protokolls. Der Hauptakteur in diesem Screening ist ein selbst entwickelter Doppelreporter-Mykobakterienstamm, der in allen Experimenten verwendet wird. Zunächst wird mit einem Reagenzienspender und planktonischen Bakterien ein erstes Screening durchgeführt, indem die Verbindungen in einer einzigen Konzentration getestet werden. Die identifizierten Treffer werden in den Validierungsassay übernommen, bei dem drei verschiedene Konzentrationen getestet werden. Beide Experimente werden mit Hilfe der Lumineszenzanzeige durchgeführt. Die validierten Treffer werden in den Infektionstest übertragen, wo ebenfalls drei verschiedene Konzentrationen getestet werden und aus dem Knochenmark stammende Makrophagen bei MOI 1 infiziert werden. Ein High-Content-Bildgebungssystem erfasst das bakterielle Fluoreszenzsignal, und eine Analysesoftware wird verwendet, um die intrazelluläre Last anhand der Mycoload-Formel zu beurteilen. Die Anzahl der Verbindungen nimmt mit zunehmender Komplexität des Assays ab. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Dieses Protokoll beschreibt eine Wirkstoff-Screening-Pipeline gegen Mab , die in selbst entwickelten Stämmenverwendet wird 10. Mit Hilfe von Liquid-Handling-Robotik, automatisierter Mikroskopie und Analyse sowie Doppelreporterstämmen wird die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell anhand von Lumineszenz oder Fluoreszenz bewertet, ohne dass Reagenzien hinzugefügt oder zusätzliche Schritte durchgeführt werden müssen. Dieser Ansatz reduziert den Zeitaufwand und die Variabilität zwischen den Assays, was ein erheblicher Vorteil ist, wenn man den Zweck von HTS-Assays berücksichtigt.
Beim Screening von Tausenden von Verbindungen muss ein wirksames Medikament leicht identifiziert werden können. Zu diesem Zweck wird häufig der Z’-Faktor verwendet, um die statistische Effektgröße zu messen und auf die Leistung des Assays zu schließen. Wenn der Z’-Faktor 0,5 >, sind die getesteten Bedingungen optimal, um zwischen behandelten und unbehandelten Populationen zu unterscheiden13. Die getesteten Bedingungen ergaben Z’-Faktoren > 0,6 (Abbildung 2), was statistisch beweist, dass sie auf eine Screening-Kampagne angewendet werden können. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Wirksamkeit des Screenings zu gewährleisten.
Aus diesem Grund wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, um die antimikrobielle Aktivität von Tausenden von Verbindungen gegen planktonwachsendes Mab nachzuweisen. Da es sich bei Mab um einen intrazellulären fakultativen Erreger handelt, schirmt das entwickelte Protokoll auch die intrazelluläre antimikrobielle Aktivität gegen denselben Bakterienstamm ab – ein entscheidender Vorteil. Darüber hinaus kann auch die Toxizität gegenüber den Wirtszellen beurteilt werden. Daher wird ein mehrstufiger Ansatz für das Wirkstoffscreening gegen Mab beschrieben, bei dem verschiedene Versuchsaufbauten verwendet werden, um die antimikrobielle Aktivität zusammen mit der Zytotoxizität zu bewerten, was die Erfolgschancen erhöht. Als Proof of Concept wurde eine chemische Bibliothek mit 1280 Verbindungen gescreent.
Insgesamt wurden dreiunddreißig Treffer identifiziert (Abbildung 3). Von diesen erhöhten drei signifikant die Lebensfähigkeit von Mykobakterien in Flüssigkulturen (Verbindungen 30, 31 und 32; Abbildung 3 und Abbildung 4). Es ist zu beachten, dass diese Verbindungen die Lumineszenzemission beeinträchtigen können, ohne die Lebensfähigkeit der Bakterien zu beeinträchtigen. Bei Tests gegen internalisierte Mykobakterien zeigten diese Verbindungen eine antimikrobielle Aktivität (Abbildung 6), was eine höhere Wirksamkeit gegen Mab nach der Internalisierung der Wirtszelle zeigte. Diese Verbindungen wurden als Troleandomycin (30), Spiramycin (32) und Lincomycin (31; Tabelle 1). Bei den ersten beiden handelt es sich um Makrolide, eine Klasse von Antibiotika, die zur Behandlung von mykobakteriellen Infektionen eingesetzt werden16, und bei letzterem handelt es sich um ein Lincosamid, ein Antibiotikum mit einem ähnlichen Wirkmechanismus wie Makrolide17. Es wurde berichtet, dass Mab sowohl in flüssigen als auch in festen Kulturen besonders resistent gegen ein anderes Lincosamid, Clindamycin, ist18. Nichtsdestotrotz wurden mit den Makroliden19,20 und Lincosamiden21 immunmodulatorische und entzündungshemmende Eigenschaften in Verbindung gebracht, was die erhöhte antimikrobielle Aktivität gegen internalisierte Mykobakterien erklären könnte (Abbildung 6).
Von den verbleibenden dreißig Treffern reduzieren elf die Lebensfähigkeit der Mykobakterien in allen Konzentrationen um >90 % (Abbildung 4). Angesichts der Tatsache, dass ein typischer HTS-Assay eine erwartete Trefferquote von ~1%22 aufweist, stimmt das entwickelte Protokoll mit dem überein, was normalerweise beobachtet wird. Nichtsdestotrotz waren mehrere andere Verbindungen noch aktiv, und achtundzwanzig wurden in den Infektionstest aufgenommen.
Von den identifizierten Verbindungen wurden fünf Verbindungen als toxisch eingestuft (Abbildung 5) – Daunorubicin (4), Doxorubicin (5), Epirubicin (27), Thiostrepton (6) und Pyrviniumpamoat (28; Tabelle 1). Bei den ersten drei handelt es sich um antineoplastische Wirkstoffe 23,24,25, so dass es nicht überrascht, dass sie für die in diesem Assay verwendeten Säugetierzellen toxisch sind. Pyrviniumpamoat wurde viele Jahre lang als wirksames Anthelminthikum verwendet; Seit 2004 wird sie jedoch auch mit antineoplastischen Aktivitäten in Verbindung gebracht26. Schließlich ist Thiostrepton ein Oligopeptid, das häufig in der Veterinärmedizin verwendet wird und nie für die Anwendung beim Menschen zugelassen wurde27. Über die Wirksamkeit dieses Arzneimittels gegen Brustkrebszellen wurde berichtet28. Die intramakrophagische Aktivität von Thiostrepton wurde aufgrund seiner Toxizität für aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen nicht untersucht (Abbildung 5). Es wurde jedoch gezeigt, dass Thiostrepton bei 5 μM auf Mab-infizierten THP-1-Zellen wirksam ist29. Die berichteten Ergebnisse gegen planktonische Bakterien29 ähneln denen, die in diesem Screening erzielt wurden, wobei Thiostrepton extrem wirksam ist (Abbildung 4).
Die meisten Verbindungen, die auf intramakrophagische Aktivität untersucht wurden, zeigten kein therapeutisches Potenzial (Abbildung 6). Das intrazelluläre Wachstum von Bakterien unterscheidet sich erheblich von Planktonkulturen. Bei letzterem ist immer ein direkter Kontakt zwischen Bakterien und Medikamenten möglich. Bei ersterem fungieren aufgrund der Internalisierung durch Wirtszellen mehrere Wirtsmembranen als physikalische Barrieren, die Medikamente transponieren müssen, um das Ziel zu erreichen, was die verminderte antimikrobielle Aktivität der meisten Treffer erklären kann. Bei der höchsten Konzentration von 13,3 μM zeigten drei Verbindungen eine ausreichende Wirksamkeit, um sich statistisch von der DMSO-Kontrolle zu unterscheiden (Abbildung 6) – Cefdinir (21), Gatifloxacin (26) und Moxifloxacin (29; Tabelle 1). Während Moxifloxacin bereits als Zweitlinienmedikament gegen Tuberkulose eingesetzt wird16, wird Cefdinir häufig zur Behandlung verschiedener bakterieller Infektionen der Atemwege, wie z. B. Lungenentzündung30, eingesetzt. Es wurde jedoch über seine Aktivität gegen M. tuberculosis31 und Mab berichtet, die eine starke synergistische Wirkung mit einem Carbapenem gegen letzteres zeigte32. Gatifloxacin ist ein Fluorchinolon, und seine Aktivität wurde in der Vergangenheit gegen mehrere Mykobakterien berichtet33,34. Die drei aktivsten Verbindungen in diesem Assay (Abbildung 6) waren Roxithromycin (17), Clarithromycin (22) und Rifabutin (25; Tabelle 1), die in allen Konzentrationen extrem wirksam sind. Die ersten beiden sind Makrolide, während Rifabutin ein Rifamycin ist, wobei beide Klassen als Grundlage für die Behandlung vieler mykobakterieller Infektionen dienen16.
Dieses Screening stützt sich auf spezielle und teure Liquid-Handling-Geräte, um die Variabilität zwischen den Assays zu reduzieren. Obwohl der Liquid Handler extrem reproduzierbar ist, verfügt er nicht über eine berührungslose Übertragung von Verbindungen, wie z. B. eine akustische. So können bestimmte adhärente Verbindungen zwischen den Transfers an den Metallstiften haften bleiben und in nachfolgende Vertiefungen übertragen werden, was während der Screening-Phase zu falsch positiven Ergebnissen führt – genau das war bei Verbindung 33 der Fall. Aus diesem Grund ist die Validierung des Screenings so entscheidend für seinen Erfolg, um sicherzustellen, dass keine falsch positiven Ergebnisse in die nächsten Schritte der Wirkstoffscreening-Pipeline übergehen. Der Infektionsassay verwendet ein High-Content-Bildgebungssystem mit einem konfokalen Modus, um die bestmögliche Definition der Bakterienregionen zu erhalten. Nichtsdestotrotz ist es immer noch möglich, es ohne konfokalen Modus zu verwenden, wenn auch mit einem Definitionsverlust und möglicherweise mit Schwierigkeiten bei der Identifizierung von Bakterienregionen. Dieses Protokoll nutzt die Vorteile der einfachen und benutzerfreundlichen Analysesoftware, die in das Bildgebungssystem integriert ist. Open-Source-Software kann jedoch nach dem Protokoll verwendet werden (Ergänzende Abbildung 5). Obwohl keine Medikamente zur Behandlung von Mab-Infektionen umfunktioniert werden, sind diese Ergebnisse letztendlich äußerst wichtig, da sie das etablierte Protokoll validieren, das auf größere Bibliotheken ausgeweitet werden kann. Wichtig ist, dass wir glauben, dass dieses Protokoll an alle Bakterien angepasst werden kann, vorausgesetzt, dass Fluoreszenz- oder Lumineszenzanzeigen verfügbar sind. Somit leistet diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur Wirkstoffforschung und liefert die notwendigen Werkzeuge, um eines der größten Probleme der öffentlichen Gesundheit zu bekämpfen – antibiotikaresistente Bakterien – und insbesondere einen fast hartnäckigen Krankheitserreger – Mycobacterium abscessus.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird aus portugiesischen nationalen Mitteln über FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P, im Rahmen des Projekts PTDC/BIA-MIC/3458/2020 (DOI: 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020) und PhD-Stipendien 2021.07335.BD an GSO und UI/BD/150830/2021 an CMB finanziert; FWO – Forschungsstiftung Flandern, Zuschuss Nr. 1S68720N; Innovative Medicine Initiative 2 Call 16 (IMI2-Call 16) Vorschlag RespiriTB unter der Vertragsnummer 853903. Die Autoren danken für die Unterstützung der i3S Scientific Platform BioSciences Screening, Mitglied der nationalen Infrastrukturen PT-OPENSCREEN (NORTE-01-0145-FEDER-085468) und PPBI – Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122).
10% Neutral buffered formalin | Bio Optica | 05-01005Q | fixation solution |
384-well black round bottom polypropylene not treated microplate | Corning | 3658 | White microplates can be used; polystyrene can be used |
50 TS Washer | BioTek | ||
Breathe-Easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
cell::explorer | Revvity | equipment handling robot | |
Clarithromycin | Sigma-Aldrich | A3487-100MG | Dissolved in DMSO to the desired concentration |
DMSO | Fisher Scientific | D/4121/PB15 | Dilute in liquid growth medium to the desired concentration |
Harmony 5.1 | Revvity | analysis software | |
Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | cell incubator | |
JANUS with 4 Tip Arm and MDT Arm | Revvity | liquid handler | |
KB 8182 | Termaks | incubator with agitation | |
Libra S4+ | Biochrom | ||
Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | ||
Opera Phenix Plus | Revvity | imaging system | |
PhenoPlate | Revvity | 6055302 | Necessary for high-content microscopes |
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x | NA | NA | washing solution |
Prestwick Chemical libraries | Commercial chemical library intended for drug repurposing | ||
Shaking incubator 3031 | GFL | ||
VICTOR Nivo | Revvity | ||
Cell culture medium: | When needed, add 10% of supplement | ||
DMEM | Gibco | 10938-025 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Gibco | 15630-056 | |
LCCM | NA | NA | Conditioned media from L929 cell line that releases Macrophage colony stimulating factor (M-CSF); cell culture medium supplement |
L-glutamin (200 mM) | Thermo Scientific | 25030024 | |
Sodium Pyruvate 100 mM (100X) | Gibco | 11360-039 | |
Infection washing solution | |||
Apirogenic water | Multiple suppliers available | ||
Hank's Balanced Salt Solution 10x | Gibco | 14060-040 | Dilute to 1x with apirogenic water |
Permeabilising Solution | PBS with 0.1% Triton X100 | ||
PBS 1x | NA | NA | |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Other suppliers available |
Staining solution | PBS with DAPI (500 ng/mL) and HCS Far Red (10 ng/mL) | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
HCS Far Red | Invitrogen | H32721 | |
PBS 1x | NA | NA | Multiple suppliers available |
Liquid growth medium | When needed, add 10% supplement | ||
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich | P4780 | 0.05% final concentration. Other suppliers available |
Liquid growth medium supplement: | |||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9702-100 | |
D-Glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 |