טיפול סיסטמי בעכברות לאחר לידה, נוער ועכברים בוגרים על ידי הזרקת סינוס רטרובולברית
概要
מאמר זה מספק פרוטוקול וסרטון נלווה להזרקת סינוס רטרובולברי של עד נפח כולל של 150 μL עבור עכברים בוגרים לאחר לידה, צעירים ובוגרים. הליך זה מתאים במיוחד להזרקת עכברים קטנים (15 גרם) כאשר הזרקת וריד הזנב אינה אפשרית.
Abstract
בעוד שהזרקות ורידי זנב משמשות לעתים קרובות כנתיב מסירה מערכתי בעכברים בוגרים, זריקות רטרובולבר הן שיטה חלופית למסירה מערכתית עם פחות מגבלות. ראשית, הזרקות ורידי זנב (TVIs) מוגבלות לעכברים בוגרים שבהם גודל וריד הזנב מתאים לגישה. להיות מוגבל לטיפול בעכברים בוגרים יכול להיות בעייתי כאשר מתמודדים עם מודלים עכברים שאינם שורדים לבגרות. שנית, TVI אינם ישימים עבור מודלים של עכברים עם פנוטיפים של פיגור גדילה שבהם העכברים לעולם אינם מגיעים לגודל של עכברי בר בוגרים. לכן, זריקות retrobulbar ניתן להשתמש בהצלחה לטיפול בעכברים צעירים ובוגרים כאחד. לבסוף, זריקות רטרובולבר מבוצעות תחת הרדמה, וזה פחות מלחיץ על העכברים מאשר TVI המבוצעות בדרך כלל ללא הרדמה. מאמר זה מציג פרוטוקול והוראות מפורטות להזרקות רטרובולבר שניתן להשתמש בהן להעברה מערכתית לעכברים קטנים וצעירים.
Introduction
מודלים מורינים של מחלות גנטיות משמשים בדרך כלל כדי להדגים את היעילות של מולקולות קטנות, גנטיקה, טיפולים תאיים1. בעכברים, השיטה הנפוצה ביותר לשכפול העברה מערכתית לבני אדם היא הזרקת וריד הזנב (TVI), המבוצעת בדרך כלל בעכברים בוגרים בסביבות גיל 6-8 שבועות כדי להבטיח שהוריד גדול מספיק כדי לגשת אליו. TVI שימש בהצלחה במספר רב של מחקרים פרה-קליניים הוכחת עקרונות של מחלות גנטיות, כגון המופיליה, אשר תמכו בניסויים קליניים בבני אדם עבור ריפוי גנטי2. אולם למודלים רבים של מחלות גנטיות יש פנוטיפים של גדילה ו/או קטלניות מוקדמת, אשר מונעים מהם להגיע לגיל או לגודל של עכבר בוגר (איור 1). טיפול בעכברים כאלה באמצעות TVI יכול להיות קשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, תלוי בגיל הקטלניות ו / או בגודל המרבי שבעלי החיים יכולים להשיג.
לעומת זאת, הזרקה סיסטמית של חומר טיפולי על ידי הזרקת סינוס רטרובולבר (המכונה לעתים קרובות ובטעות רטרו-אורביטל) יכולה להיעשות די בקלות בעכברים ללא קשר לגיל או לגודל3. זריקות רטרובולבר של וירוס הקשור לאדנו (AAV) שימשו בהצלחה במודלים מורינים צעירים עם עיכוב גדילה של מחלות גנטיות, כגון חומצה מתילמלונית (MMA) ומחלת נימן-פיק מסוג C 4,5,6,7,8. (הליך זה יכול לשמש גם להזרקת יילודים 3,4,9,10; עם זאת, טכניקה זו אינה מפורטת בפרוטוקול זה או בסרטון הנלווה.) אפילו חומרים רעילים מאוד כמו דוקסורוביצין יכולים להיות מועברים בבטחה על ידי הזרקת רטרובולבר 11,12. בניגוד ל-TVI, עכברים מורדמים במהלך הזרקות סינוס רטרובולברי, מה שהופך את ההליך לפחות מלחיץ על העכבר ומקל על המפעיל שאינו צריך לרסן פיזית את העכבר13,14. חשש נוסף הוא ש-TVI משתמש לעתים קרובות במנורת חום כדי להרחיב את וריד הזנב, מה שעלול לגרום להתייבשות בעכברים צעירים ועלול להיות בעייתי במודלים של מחלות גנטיות החשודות יותר ללחץ הקשור לחום. בעיה נוספת שיכולה להתעורר בעת שימוש ב- TVI היא שווריד הזנב יכול להיות מאתגר במיוחד לדמיין על עכברים בעלי פיגמנטציה גבוהה. עם זאת, בדומה ל-TVI, זריקות רטרובולבר לסינוסים מביאות לפיזור ביולוגי מערכתי רחב15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד הזרקת רטרובולבר היא שיטה אמינה להעברת מולקולות קטנות, חלבונים וטיפולים גנומיים, תרגול הטכניקה עם צבע הוא הכרחי כדי להבטיח כי אספקה מערכתית אמינה וניתנת לשכפול מושגת. השימוש בצבע מומלץ מאוד לתרגול הזרקות רטרובולבר בעכברים לפני השימוש במסלול העברה זה בניסויים. ניתן לבדוק את הצבעים באופן חזותי ברקמות העכבר כדי להבטיח אספקה מערכתית עקבית.
בהדגמה שלנו של טכניקת הזרקת retrobulbar, גז isoflurane שימש להרדים את העכברים לפני ההליך. ניתן להשתמש בצורות אחרות של הרדמה לפני ההליך, אך חשוב לוודא שהעכבר אינו מתאושש מהטשטוש לפני השלמת ההזרקה. למרבה המזל, ההזרקה בפועל אורכת בדרך כלל פחות מדקה והזמן שבו העכבר צריך להיות מורדם לחלוטין הוא קצר. העכבר צריך להיות מורדם לחלוטין במהלך ההזרקה, ואת ההרדמה יש לקרוא אם העכבר הופך להכרה לפני ההזרקה. מכיוון שישנם סיכונים הקשורים לשימוש בהרדמה, יש למזער את משך הזמן שהעכבר מורדם. לא היו לנו בעיות בשימוש באיזופלורן כדי להרדים עכברים חולים קטנים עם חומצה מתילמלונית ופרופיונית. עם זאת, דגמים מסוימים של עכברים עשויים להיות רגישים יותר לטשטוש ולהרדמה מסוימת. יש לשקול בעיה פוטנציאלית זו לפני ניסיון להשתמש בסדציה במחקר. לבסוף, השימוש בטשטוש בשילוב עם הזרקת רטרובולבר מפחית מאוד את המצוקה לכאורה שהעכבר מפגין בתהליך ההזרקה בהשוואה ל- TVI שם לא נעשה שימוש נפוץ בטשטוש.
לא ראינו בעיות הקשורות לאחר הזרקה, אם כי זיהום הוא סיכון פוטנציאלי עם כל זריקה. כדי להפחית את הסיכוי להדבקה, מזרק חד פעמי סטרילי ו- PBS סטרילי כדי לדלל את AAV מטוהר משמשים. כל העכברים במתקן בעלי החיים שלנו נבדקים מדי יום לאיתור סימנים לבעיות בריאותיות פוטנציאליות ומקבלים טיפול וטרינרי כדי לטפל בכל בעיה בריאותית בעת הצורך.
החלופה להזרקת סינוס רטרובולבר והשיטה הנפוצה יותר להעברה מערכתית לעכברים צעירים ובוגרים היא TVI. הזרקת TVI ורטרובולבר לסינוסים גורמת להתפלגות ביולוגית דומה במקרה של מולקולות קטנות ונוגדנים, ועל ידי אקסטרפולציה, אותו הדבר צפוי עבור וקטורים נגיפיים15,16. עם זאת, לא ניתן למצוא דוגמאות להשוואה בין העברה מערכתית של וקטורים של ריפוי גנטי על ידי TVI לבין הזרקת סינוס רטרובולברי בספרות. לדעתנו, זריקות סינוס רטרובולבריות קלות יותר לביצוע בעכברים עם פנוטיפ גדילה מופחת ו/או קטלניות מוקדמת.
TVI נחשב לעתים קרובות כמקביל יותר להעברה מערכתית בבני אדם, למרות שלבני אדם יש סינוס רטרובולברי אך אין לו זנב. בהיבט אחד, הזרקת סינוס רטרובולברי דומה להזרקה מערכתית אנושית בכך שהמזרק נכנס למערכת הוורידית העליונה בדומה להזרקה שהועברה לאדם על ידי צנתר מרכזי מוחדר היקפית (PICC Line) או צנתר תוך ורידי שהוכנס לזרוע. לעומת זאת, המזרק נכנס למערכת הוורידית התחתונה של עכבר לאחר הזרקת ורידים בזנב. למרבה הצער, אף אחת מהשיטות הללו אינה משכפלת במדויק את השיטות(ות) המשמשות להעברה מערכתית בבני אדם, אך שתיהן שיטות יעילות להעברה מערכתית בעכברים.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים את הסיוע של צוות מתקן העכבר NHGRI, המעבדה לפתולוגיה מולקולרית של NCI, ובמיוחד אנדרו וורנר. R.J.C. נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של NHGRI באמצעות 1ZIAHG200318-16 ועבודה זו מומנה חלקית על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS). איור 2C נוצר באמצעות BioRender.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
参考文献
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Samelson-Jones, B. J., George, L. A. Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia. Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retrobulbar injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).
- Chandler, R. J., et al. Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1. Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).
- Venturoni, L. E., et al. Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing. Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).
- Ilyinskii, P. O., et al. Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).
- Davidson, C. D., et al. Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice. Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040 (2021).
- Chandler, R. J., et al. Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia. Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).
- Rocha-Ferreira, E., et al. A neonatal rodent model of retroorbital vein injection. J Vis Exp. (204), e65386 (2024).
- Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin. J Vis Exp. (135), e57642 (2018).
- Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).
- Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).
- Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice. J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).
- Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies. Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
.