Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료
概要
이 기사는 산후, 청소년 및 런트 성인 마우스에 대해 최대 총 150μL의 후불동 주사에 대한 프로토콜과 동반 비디오를 제공합니다. 이 시술은 꼬리 정맥 주입이 불가능한 작은 마우스(15g)의 주사에 특히 적합합니다.
Abstract
꼬리 정맥 주사는 성체 마우스에서 전신 분만 경로로 자주 사용되지만, 후구 주사는 제한이 적은 전신 분만을 위한 대체 방법입니다. 첫째, 꼬리 정맥 주사(TVI)는 꼬리 정맥의 크기가 접근에 적합한 성인 마우스로 제한됩니다. 성체 마우스를 치료하는 것으로 제한되는 것은 성인이 될 때까지 생존하지 않는 마우스 모델을 다룰 때 문제가 될 수 있습니다. 둘째, TVI는 마우스가 성인 야생형 마우스의 크기를 달성하지 못하는 성장 지연 표현형을 가진 마우스 모델에는 적합하지 않습니다. 따라서 retrobulbar 주사는 젊은 쥐와 작은 성인 쥐 모두를 치료하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 후구근 주사는 마취 하에 수행되는데, 이는 일반적으로 마취 없이 수행되는 TVI보다 마우스에 대한 스트레스가 적습니다. 이 논문에서는 작고 어린 마우스에 대한 전신 전달에 사용할 수 있는 retrobulbar 주사에 대한 프로토콜과 자세한 지침을 제시합니다.
Introduction
유전 질환의 쥐 모델은 일반적으로 소분자, 유전 및 세포 치료의 효능을 입증하는 데 사용됩니다1. 생쥐에서 인간에게 전신 전달을 복제하는 데 가장 널리 사용되는 방법은 꼬리 정맥 주사(TVI)이며, 이는 일반적으로 생후 약 6-8주에 성인 생쥐에서 정맥이 접근할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하기 위해 수행됩니다. TVI는 혈우병과 같은 유전 질환에 대한 수많은 전임상 원리 증명 연구에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 유전자 치료를 위한 인간 임상 시험을 지원했다2. 그러나 유전 질환의 많은 쥐 모델에는 성장 및/또는 조기 치사 표현형이 있어 성인 마우스의 연령이나 크기에 도달하는 데 방해가 됩니다(그림 1). TVI를 통해 이러한 마우스를 치료하는 것은 치사율의 연령 및/또는 동물이 달성할 수 있는 최대 크기에 따라 불가능하지는 않더라도 매우 어려울 수 있습니다.
대조적으로, retrobulbar(빈번하고 부적절하게 retro-orbital이라고 함) 부비동 주사에 의한 치료제의 전신 전달은 연령이나 크기에 관계없이 마우스에서 매우 쉽게 수행할 수 있습니다3. 아데노 관련 바이러스(AAV)의 후불 주사는 메틸말론산혈증(MMA) 및 Niemann-Pick C형 질환 4,5,6,7,8과 같은 유전 질환의 젊은 성장 지연 쥐 모델에서 성공적으로 사용되었습니다. (이 절차는 신생아 3,4,9,10을 주입하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 이 프로토콜이나 함께 제공되는 비디오에 자세히 설명되어 있지 않습니다.) 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성이 강한 물질조차도 후불 주사에 의해 안전하게 전달될 수 있다11,12. TVI와 달리, 마우스는 후구동 주사 중에 마취되는데, 이는 마우스에 대한 절차를 덜 스트레스 받게 하고 마우스를 물리적으로 제지할 필요가 없는 작업자에게 더 쉽게 만든다13,14. 또 다른 우려는 TVI가 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열 램프를 자주 사용한다는 것인데, 이는 잠재적으로 어린 쥐에서 탈수를 유발할 수 있고 열 관련 스트레스가 더 의심되는 유전 질환의 쥐 모델에서 문제가 될 수 있습니다. TVI를 사용할 때 발생할 수 있는 또 다른 문제는 색소가 많은 마우스에서 꼬리 정맥을 시각화하기가 특히 어려울 수 있다는 것입니다. 그러나, TVI와 같이, 후구동 주사는 광범위한 전신 생체 분포를 초래한다15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
retrobulbar 주입은 소분자, 단백질 및 게놈 요법을 전달하는 신뢰할 수 있는 방법이지만, 신뢰할 수 있고 복제 가능한 전신 전달을 보장하기 위해서는 염료로 이 기술을 연습하는 것이 필요합니다. 염료의 사용은 실험에서 이 전달 경로를 사용하기 전에 마우스에서 retrobulbar 주입을 연습하는 데 적극 권장됩니다. 염료는 마우스 조직에서 육안으로 확인할 수 있어 일관된 전신 전달을 보장할 수 있습니다.
retrobulbar 주입 기술에 대한 우리의 시연에서, 이소플루란 가스는 절차 전에 마우스를 마취하기 위해 사용되었다. 시술 전에 다른 형태의 마취를 사용할 수 있지만 주사가 완료되기 전에 마우스가 진정제에서 회복되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 다행히도 실제 주입은 일반적으로 1분 미만이 소요되며 마우스를 완전히 마취해야 하는 시간은 짧습니다. 주사하는 동안 마우스를 완전히 진정시켜야 하며, 주사 전에 마우스가 의식을 갖게 되면 마취를 다시 투여해야 합니다. 마취 사용과 관련된 위험이 있기 때문에 마우스가 진정되는 시간을 최소화해야 합니다. 우리는 메틸말론산혈증과 프로피온산혈증이 있는 작고 아픈 쥐를 진정시키기 위해 이소플루란을 사용하는 데 문제가 없었습니다. 그러나 일부 마우스 모델은 진정 및 특정 마취에 더 민감할 수 있습니다. 연구에서 진정제를 사용하려고 시도하기 전에 이 잠재적인 문제를 고려해야 합니다. 마지막으로, 후구 주사와 함께 진정제를 사용하면 진정제가 일반적으로 사용되지 않는 TVI에 비해 주사 과정에서 쥐가 보이는 명백한 고통을 크게 줄일 수 있습니다.
주사 후 관련 문제는 관찰되지 않았지만 모든 주사에 감염이 발생할 수 있습니다. 감염 가능성을 줄이기 위해 멸균된 AAV를 희석하기 위한 멸균 일회용 주사기와 멸균 PBS가 사용됩니다. 우리 동물 시설의 모든 쥐는 잠재적인 건강 문제의 징후가 있는지 매일 확인하고 필요한 경우 건강 문제를 해결하기 위해 수의학적 치료를 받습니다.
후구동 주사의 대안이자 청소년 및 성인 마우스에 대한 전신 전달의 더 널리 사용되는 방법은 TVI입니다. TVI 및 retrobulbar sinus 주입은 작은 분자 및 항체의 경우 유사한 생체 분포를 초래하며, 외삽에 의해 바이러스 벡터에 대해서도 동일한 결과가 예상됩니다15,16. 그러나 TVI와 후불동 주사에 의한 유전자 치료 벡터의 전신 전달을 비교한 예는 문헌에서 찾을 수 없었다. 우리의 의견으로는, retrobulbar sinus 주사는 성장 표현형이 감소하거나 조기 치사율이 있는 마우스에서 수행하기가 더 쉽습니다.
TVI 는 인간에게 후구동이 있지만 꼬리가 없음에도 불구하고 인간의 전신 분만과 더 유사한 것으로 간주되는 경우가 많습니다. 일 측면에서, 후구동 주사제는 말초에 삽입된 중앙 카테터(PICC Line) 또는 팔에 배치된 정맥 카테터에 의해 주사제가 사람에게 전달된 것과 동일하게 주사제가 상부 정맥계로 진입한다는 점에서 인간 전신 전달과 유사합니다. 반대로, 주사제는 꼬리 정맥 주사 후 쥐의 하부 정맥 시스템으로 들어갑니다. 불행히도, 이러한 방법 중 어느 것도 인간에서 전신 전달에 사용되는 방법을 정확히 복제하지 않지만, 둘 다 마우스에서 전신 전달에 효과적인 방법입니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NHGRI 마우스 시설 직원, NCI 분자 병리학 연구소, 특히 Andrew Warner의 도움에 감사드립니다. R.J.C.는 1ZIAHG200318-16을 통해 NHGRI의 교내 연구 프로그램의 지원을 받고 있으며, 이 연구는 NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)의 일부 자금 지원을 받았습니다. 그림 2C 는 BioRender로 생성되었습니다.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
参考文献
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