Systemische behandeling voor postnatale, juveniele en gerunde volwassen muizen door retrobulbaire sinusinjectie

Dit protocol en de bijbehorende video zijn voor de retrobulbaire injectieruimte van postnatale, juveniele en gerunde volwassen muizen door retrobulbaire sinusinjectie; het protocol is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) van het National Human Genome Research Institute onder protocolnummer G-03-4. Andere instellingen kunnen andere vereisten en beperkingen hebben, en dit protocol moet mogelijk worden gewijzigd voor goedkeuring in uw instituut. Verkrijg goedkeuring van de ACUC van uw instelling voordat u deze of een andere dierprocedure uitvoert. 1. Voorbereiding vóór de injectie Verdun de AAV tot het gewenste injectievolume en de gewenste concentratie met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml voor elke injectie. Voeg een extra volume van 50% toe voor elke injectie om een nauwkeurige vulling van de steriele spuit voor eenmalig gebruik mogelijk te maken.OPMERKING: Hier verdunnen we een AAV8-CAG-eGFP-reporter om een dosis van 1 × 1013virale genomen per kg lichaamsgewicht (vg/kg) af te geven in een volume van 50 μL. De hoeveelheid AAV in de te injecteren 50 μL wordt berekend aan de hand van het gewicht van het dier op het moment van injectie. In deze video wordt AAV geïnjecteerd via de retrobulbaire route om systemische toediening bij mensen na te bootsen. Andere gentherapievectoren (d.w.z. lentivirus, adenovirus), RNA-therapieën en kleine moleculen kunnen systemisch worden toegediend met behulp van deze procedure. Zorg ervoor dat het tafelmodel anesthesiesysteem voor proefdieren (LAAS) correct is ingesteld en correct functioneert in overeenstemming met de instructies van de fabrikant.OPMERKING: Als een alternatieve anesthesiemethode wordt gebruikt, zorg er dan voor dat de verdoving is voorbereid voordat met de injecties wordt begonnen. De retrobulbaire injectieprocedure moet compatibel zijn met de meeste anesthesieën (bijv. een injecteerbare chemische fixatie zoals ketamine en xylazine). Voordat u de steriele spuit voor eenmalig gebruik vult (in dit geval een insulinespuit, 31 G, 8 mm lang, 3/10 ml inhoud), beweegt u de zuiger meerdere keren op en neer om ervoor te zorgen dat de zuiger soepel kan worden ingedrukt. Vul vervolgens de spuit tot het gewenste volume en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.OPMERKING: Volumes tot 150 μL kunnen worden geïnjecteerd; ons laboratorium injecteert doorgaans een volume van 50 μL. 2. Sedatie bij muizen via toediening van isofluraangas met een anesthesiesysteem voor proefdieren (LAAS) Zorg ervoor dat het gas alleen naar de inductiekamer stroomt. Draai de tweewegkraan naar het niet-rebreathing-circuit (NRB) dicht. Draai de groene zuurstofstroomknop aan de voorkant van de debietmeter aan zodat er een debiet van 1 l/min is. Draai isofluraan naar ≤4% door de hendel aan de bovenkant van de verdamper in te drukken en de draaiknop naar de gewenste concentratie te draaien. Plaats de muis in de doorzichtige inductiekamer. Let goed op de ademhaling en beweging van het dier. Zodra het dier ligt, draai je de verdamperknop naar beneden tot 2-2,5% isofluraan. Open de tweewegkraan naar het NRB-circuit dat aan het gezichtsmasker is bevestigd en sluit de gastoevoer naar de inductiebox. Verwijder het dier en plaats het in het mondmasker van het NRB-circuit. Verlaag de instelling van de isofluraanconcentratie naar 1,5%-1,75%, afhankelijk van de reactie op stimuli (bijv. teenknijpen of pootknijpen). Controleer altijd continu de ademhaling en de kleur van de slijmvliezen van de muis (indien mogelijk). Als de ademhaling van het dier moeizaam wordt of de kleur van de slijmvliezen niet roze is, verlaag dan de verdovingsconcentratie. Houd het dier gedurende de hele procedure warm. Gebruik een handwarmer gewikkeld in een papieren handdoek die onder de onderlegger wordt geplaatst en zich direct onder de muis bevindt. Schakel de zuurstof en de verdamper uit na voltooiing van de procedure. 3. Injectie van het dier Als u rechtshandig bent, injecteert u het rechteroog van de muis en plaatst u de muis op de linkerzij met de snuit naar de rechterhand gericht. Als u linkshandig bent, injecteert u het linkeroog van de muis en plaatst u de muis op de rechterkant met de snuit naar de linkerhand gericht. Breng een of twee druppels oogheelkundige verdoving aan op de oogbol, die moet worden geïnjecteerd. Verwijder vervolgens een teveel aan oogheelkundige anesthesieoplossing met behulp van een steriel absorberend gaasje. Oefen lichte druk uit met de vingertoppen op de huid dorsaal en ventrale op het oog om de oogbol van de muis gedeeltelijk uit de oogkas te steken (Figuur 2A,B).OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen overmatige druk uitoefent op de omliggende halsvaten wanneer u het oog uitsteekt, omdat dit de bloedstroom en injectie belemmert. Bovendien kan het uitoefenen van druk op de luchtpijp voorkomen dat de muis ademt. Zorg ervoor dat de muis tijdens de procedure kan ademen. Houd de naald in een afgeschuinde positie in een hoek van ongeveer 30° en plaats deze in de mediale canthus (Figuur 2C).OPMERKING: De diepte van de plaatsing van de naald om de retrobulbaire sinus te bereiken, is afhankelijk van de grootte van het dier. Door de naald tijdens de injectie in de afgeschuinde positie te houden, wordt het risico op oogbeschadiging verkleind. Pas op dat u de naald niet te diep plaatst en de oogkas doorboort. De injectie duurt minder dan een minuut. Oefen langzaam en soepel druk uit op de zuiger van de spuit om de injectie toe te dienen. Dit verkleint de kans op extravasatie. Verwijder de naald langzaam en soepel. Verwijder het gezichtsmasker van de muis om herstel van de anesthesie mogelijk te maken. 4. Na injectie Schakel de zuurstof en de verdamper uit na voltooiing van de procedure. Gebruik een steriel gaasje om bloed te verwijderen als er nog een bloeding optreedt. Zorg ervoor dat de muis zich in een warme ruimte bevindt (ongeveer 37 °C), maar niet te heet, om onderkoeling tijdens het herstel van de anesthesie te voorkomen. Observeer de muis geïsoleerd totdat deze volledig hersteld is voordat u de muis terugplaatst in de kooi en het rek.OPMERKING: Het isoleren van de muis tijdens het herstel voorkomt dat kooigenoten de verdoofde muis verwonden tijdens het herstel.