Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.
Es wurde ein fortschrittliches Darm-on-Chip-Modell entwickelt, das epitheliale 3D-organotypische zottenartige und kryptenartige Strukturen nachbildet. Das immunkompetente Modell umfasst humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC), Caco-2-Darmepithelzellen, geweberesidente Makrophagen und dendritische Zellen, die sich selbst im Gewebe organisieren und die Eigenschaften der menschlichen Darmschleimhaut widerspiegeln. Ein einzigartiger Aspekt dieser Plattform ist ihre Fähigkeit, zirkulierende menschliche primäre Immunzellen zu integrieren, was die physiologische Relevanz erhöht. Das Modell soll die Reaktion des intestinalen Immunsystems auf bakterielle und pilzliche Besiedlung und Infektion untersuchen. Aufgrund seiner vergrößerten Kavitätengröße bietet das Modell vielfältige funktionelle Messwerte wie Permeationsassays, Zytokinfreisetzung und Immunzellinfiltration und ist kompatibel mit der Immunfluoreszenzmessung von 3D-Strukturen, die von der Epithelzellschicht gebildet werden. Dabei bietet es umfassende Einblicke in die Zelldifferenzierung und -funktion. Die Darm-on-Chip-Plattform hat ihr Potenzial bei der Aufklärung komplexer Wechselwirkungen zwischen Surrogaten einer lebenden Mikrobiota und menschlichem Wirtsgewebe innerhalb einer mikrophysiologischen durchbluteten Biochip-Plattform unter Beweis gestellt.
Organ-on-Chip (OoC)-Systeme stellen eine aufstrebende Technik der 3D-Zellkultur dar, die in der Lage ist, die Lücke zwischen herkömmlichen 2D-Zellkulturen und Tiermodellen zu schließen. OoC-Plattformen bestehen in der Regel aus einem oder mehreren Kompartimenten, die gewebespezifische Zellen enthalten, die auf einer Vielzahl von Gerüsten wie Membranen oder Hydrogelen gezüchtetwerden 1. Die Modelle sind in der Lage, eine oder mehrere definierte organotypische Funktionen nachzuahmen. Pumpen ermöglichen die kontinuierliche mikrofluidische Perfusion von Zellkulturmedium zur Entfernung zellulärer Abfallprodukte, zur Versorgung mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren für eine verbesserte zelluläre Differenzierung und zur Wiederherstellung wesentlicher In-vivo-Bedingungen. Durch die Integration von Immunzellen können OoC-Systeme die menschliche Immunantwort in vitro nachahmen 2. Bisher wurde ein breites Spektrum an Organen und Funktionseinheiten vorgestellt1. Zu diesen Systemen gehören Modelle des Gefäßsystems3, der Lunge4, der Leber 2,5 und des Darms6, die für Arzneimitteltests 5,7 und Infektionsstudien 6,8 ermöglicht werden können.
Wir präsentieren hier ein humanes Darm-on-Chip-Modell, das humane Epithelzellen integriert, die eine organotypische 3D-Topographie von zottenartigen und kryptenartigen Strukturen bilden, kombiniert mit einer Endothelauskleidung und geweberesidenten Makrophagen. Das Modell wird in einem mikrofluidisch perfundierten Biochip in Form eines mikroskopischen Objektträgers kultiviert. Jeder Biochip besteht aus zwei separaten mikrofluidischen Kavitäten. Jeder Hohlraum ist durch eine poröse Polyethylenterephthalat (PET)-Membran in eine obere und eine untere Kammer unterteilt. Die Membran selbst dient auch als Gerüst für das Wachstum der Zellen auf jeder Seite. Die Poren der Membran ermöglichen zelluläres Übersprechen und Zellmigration zwischen den Zellschichten. Jede Kammer ist über zwei weibliche Luer-Lock-Anschlüsse zugänglich. Optional kann ein zusätzlicher Mini-Luer-Anschluss in der Größe eines Locks den Zugang zur oberen oder unteren Kammer ermöglichen (Abbildung 1).
Die OoC-Plattform bietet eine Reihe von Messwerten, die aus einem einzigen Experiment gewonnen werden können. Der Darm-on-Chip ist auf die Kombination von perfundierter 3D-Zellkultur, Abwasseranalyse und Fluoreszenzmikroskopie zugeschnitten, um die Zellmarkerexpression, die Metabolisierungsraten, die Immunantwort, die mikrobielle Besiedlung und Infektion sowie die Barrierefunktion zu beurteilen 3,6,8. Das Modell umfasst geweberesidente Immunzellen und den direkten Kontakt lebender Mikroorganismen mit dem Wirtsgewebe, was im Vergleich zu anderen veröffentlichten Modellen einen Vorteil darstellt9. Darüber hinaus organisieren sich Epithelzellen selbst zu dreidimensionalen Strukturen, die eine physiologisch relevante Schnittstelle für die Besiedlung mit einer lebenden Mikrobiota darstellen6.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Generierung eines immunkompetenten Darm-on-Chip-Modells. Wir haben spezifische Techniken und mögliche Auslesemethoden wie Immunfluoreszenzmikroskopie, Zytokin- und Metabolitenanalyse, Durchflusszytometrie, Protein- und Genanalyse sowie Permeabilitätsmessung beschrieben.
Das beschriebene Modell besteht aus primären HUVECs, Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen, die mit einer 3D…
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeiten wurden finanziell unterstützt durch den Sonderforschungsbereich PolyTarget 1278 (Projektnummer 316213987) an V.D.W. und A.S.M. A.F. und A.S.M. würdigen ferner die finanzielle Unterstützung durch den Exzellenzcluster “Balance of the Microverse” im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC 2051 – Projekt-ID 690 390713860. Wir danken Astrid Tannert und dem Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) dafür, dass sie uns Zugang zu ihrem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ZEISS LSM980 zur Verfügung gestellt haben. Abbildung 1C und Abbildung 2 wurden mit Biorender.com erstellt.
96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |