장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델
概要
당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.
Abstract
상피 3D 기관형 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조를 재현하는 고급 intestine-on-chip 모델이 개발되었습니다. 면역 역량 모델에는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), Caco-2 장 상피 세포, 조직 거주 대식세포 및 수지상 세포가 포함되며, 이들은 인간 장 점막의 특성을 반영하여 조직 내에서 자체 조직화됩니다. 이 플랫폼의 독특한 측면은 순환하는 인간 1차 면역 세포를 통합하여 생리학적 관련성을 향상시키는 능력입니다. 이 모델은 박테리아 및 진균 집락 형성 및 감염에 대한 장 면역 체계의 반응을 조사하도록 설계되었습니다. 확대된 캐비티 크기로 인해 이 모델은 투과 분석, 사이토카인 방출 및 면역 세포 침투와 같은 다양한 기능적 판독을 제공하며 상피 세포층에 의해 형성된 3D 구조의 면역형광 측정과 호환됩니다. 이를 통해 세포 분화 및 기능에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. intestine-on-chip 플랫폼은 미세생리학적 관류 바이오칩 플랫폼 내에서 살아있는 미생물군의 대리모와 인간 숙주 조직 간의 복잡한 상호 작용을 규명할 수 있는 잠재력을 입증했습니다.
Introduction
OoC(Organ-on-Chip) 시스템은 기존의 2D 세포 배양과 동물 모델 간의 격차를 해소할 수 있는 새로운 3D 세포 배양 기술입니다. OoC 플랫폼은 일반적으로 멤브레인 또는 하이드로겔과 같은 다양한 골격체에서 성장한 조직 특이적 세포를 포함하는 하나 이상의 구획으로 구성됩니다1. 이 모델은 하나 이상의 정의된 유기형 기능을 모방할 수 있습니다. 펌프는 세포 배양 배지의 지속적인 미세유체 관류를 가능하게 하여 세포 폐기물을 제거하고, 세포 분화 개선을 위한 영양 및 성장 인자를 공급하고, 필수적인 생체 내 조건을 재현할 수 있습니다. 면역 세포의 통합으로 OoC 시스템은 in vitro2에서 인간의 면역 반응을 모방할 수 있습니다. 현재까지 다양한 장기와 기능 단위가 제시되었습니다1. 이러한 시스템에는 약물 검사(drug testing)5,7 및 감염 연구(infection studies)6,8를 위해 촉진될 수 있는 혈관구조(vasculature)3, 폐4, 간(liver)2,5 및 장(intestine)6의 모델이 포함된다.
여기에서는 인간 상피 세포를 통합하는 인간 장 온 칩 모델을 제시하며, 내피 내벽 및 조직 상주 대식세포와 결합된 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 유기체형 3D 지형을 형성합니다. 이 모델은 미세한 슬라이드 형태의 미세유체 관류 바이오칩에서 배양됩니다. 각 바이오칩은 두 개의 개별 미세유체 공동으로 구성됩니다. 각 캐비티는 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인에 의해 상부 및 하부 챔버로 나뉩니다. 멤브레인 자체는 세포가 양쪽에서 자랄 수 있는 발판 역할도 합니다. 막의 기공은 세포 누화와 세포층 사이의 세포 이동을 가능하게 합니다. 각 챔버는 두 개의 암형 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 접근할 수 있습니다. 선택적으로, 추가적인 미니 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 상부 또는 하부 챔버에 접근할 수 있습니다(그림 1).
OoC 플랫폼은 단일 실험에서 얻을 수 있는 여러 판독값을 제공합니다. Intestine-on-Chip은 관류 3D 세포 배양, 유출물 분석 및 형광 현미경을 결합하여 세포 마커 발현, 대사 속도, 면역 반응, 미생물 집락 형성 및 감염, 장벽 기능 3,6,8을 평가하도록 맞춤화되었습니다. 이 모델에는 조직에 상주하는 면역 세포와 살아있는 미생물이 숙주 조직과 직접 접촉하는 것이 포함되는데, 이는 발표된 다른 모델에 비해 이점이 있다9. 또한, 상피세포는 3차원 구조로 자가조직화되어 살아있는 미생물군(living microbiota)과의 집락화에 생리학적으로 유의미한 인터페이스를 제공한다6.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 면역 능력이 있는 장-온-칩 모델을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다. 면역형광 현미경 검사, 사이토카인 및 대사산물 분석, 유세포 분석, 단백질 및 유전자 분석, 투과성 측정과 같은 특정 기술과 가능한 판독 방법을 설명했습니다.
기술된 모델은 6,14 이전에 기술된 바와 같이 점액 분비, 흡수성, 장?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 V.D.W.와 A.S.M. 및 A.S.M. A.F. 및 A.S.M.에 대한 공동 연구 센터 PolyTarget 1278(프로젝트 번호 316213987)의 재정 지원을 받았으며, 독일의 Excellence Strategy – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860에 따른 Cluster of Excellence “Balance of the Microverse”의 재정 지원을 인정합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 ZEISS LSM980을 사용할 수 있도록 지원해 준 Astrid Tannert와 Jena Biophotonic and Imaging Laboratory(JBIL)에 감사드립니다. 그림 1C와 그림 2 는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
参考文献
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