Zoonotik Nematodların Tarla ve Laboratuvar Koşullarında Teşhis Edilmesi İçin Basit Bir Fekal Flotasyon Yöntemi

Gastrointestinal parazitler, köpekleri etkileyen en yaygın sağlık sorunlarından biridir¹. Tahminler, dünya çapında ~ 700 milyon evcil köpek olduğunu ve yaklaşık 175 milyonunun serbest dolaşım² olarak kategorize edilebileceğini göstermektedir. Köpekler ve insanlar arasında 60’tan fazla parazit türü paylaşılmaktadır, bu da köpeklerin bu parazitlerle insanlar için bir enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir³. Toxocara canis ve Ancylostoma caninum, köpekleri ve yanlışlıkla insan konakçıları enfekte eden iki parazitik türdür. Şu anda, bu helmintlerin Meksika’da hayatta kalabildikleri ve üreyebildikleri yerler hakkında birkaç çalışma var. Köpeklerde Toxocara prevalansı Amerika Birleşik Devletleri, Meksika, Orta Amerika ve Karayipler’de %0 ile %87 arasında değişmektedir⁴. Toxocara canis ve Ancylostoma spp., köpeklerde diğer parazitik türlerin yanı sıra, daha önce Meksika’da ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13} bildirilmiştir (Tablo 1).

Tablo 1: 2001’den 2020’ye kadar Meksika’da köpek parazitlerinin bölgesel yaygınlığı (%) 2001’den 2020’ye kadar yürütülen önceki araştırmalardan elde edilen bulgular, Meksika’daki çeşitli kentsel ve kırsal ortamlarda köpek parazit dağılımının belirlenmesini sağlamıştır. Bu çalışmalar, farklı ekosistemlerde köpek parazitlerinin kalıcılığına yardımcı olan epidemiyolojik unsurların derinlemesine anlaşılmasını sağlayarak, bazı parazit türlerinin zoonotik etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesine katkıda bulunur.

Yumurtalar, kistler, ookistler veya larvalar gibi bağırsak parazitlerinin yaşam döngüsü aşamaları dışkı örneklerinde bulunabilir. Bu nedenle, dışkı materyalinin incelenmesi, bir hayvanın parazitleri hakkında değerli bilgiler sağlar. İnsan dışkısında Ancylostomidae yumurtalarını tespit etmek için bir yönteme duyulan ihtiyaç, 1878’de gastrointestinal parazitleri tespit etmek için uzun yıllar kullanılan ancak çok hassas olmadığı düşünülen basit dışkı yaymasının kullanılmasına yol açtı. Bu nedenle, daha iyi kopromikroskobik yöntemler geliştirme ihtiyacı ortaya çıkmıştır¹⁴. Dışkı örneklerinde parazit yumurtalarının geri kazanılması ve sayılması için yüzdürme tekniğinin ilk kez tanımlanmasından bu yana¹⁰⁰ yıldan fazla zaman geçmiştir 15. O zamandan beri, yüzdürme tekniğinin çeşitli yöntemleri ve varyantları, konakçılarında bazı parazitlerin tespiti için bir standart olarak kabul edilmiştir.

Örneğin, Lane, 1924’te, santrifüjlemeyi ve ardından tortuyu 1 g (Lane) veya 10 g (Stoll’un modifikasyonu) SpG 1.2 ile doymuş bir sodyum klorür çözeltisi içinde yüzdürmeyi entegre eden doğrudan santrifüjlü yüzdürme tekniğini içeren bir yöntem tanımladı. Yüzdürme tekniği daha sonra farklı SpG^14’e sahip çözeltiler kullanılarak değiştirildi. 1939’da Gordon ve Whitlock, parazit yumurtalarının görselleştirilmesinde döküntülerin müdahalesi nedeniyle Stoll’un tekniğinin dezavantajlarını bildirdiler ve McMaster¹⁶ olarak bilinen kantitatif yöntemi geliştirdiler. 1979’da O’Grady ve Slocombe, çözeltinin özgül ağırlığının, zamanlamasının ve süzgeçlerin ağ boyutlarının, yüzdürme tekniğini kullanarak yumurta tespitinin doğruluğunu etkilediğini^{gösterdi 17}. Son yıllarda, yüzdürme tekniğinde çeşitli değişiklikler yapıldığından, yüzdürme yöntemlerinin standardizasyonuna acil bir ihtiyaç vardır. Şu anda, zoonotik nematodların enfeksiyöz aşamaları ile çevresel kontaminasyonu sınırlamak için uygun antelmintik tedavilerin uygulanması için zoonotik parazitlerin önlenmesi bağlamında köpek helmint enfeksiyonlarının saptanması gerekmektedir¹⁸.

Kalitatif yöntemler arasında fekal flotasyon tekniği, fazla ekipman gerektirmediği, basit, ucuz ve tekrarlanabilir olduğu için yaygın olarak kullanılmakta ve kabul edilmektedir; Yine de, enfeksiyonun yoğunluğu düşük olduğunda duyarlılıktan yoksun olması nedeniyle büyük bir dezavantajı vardır¹⁹. Yumurtalar, ookistler, kistler veya nematod larvaları gibi daha fazla sayıda parazitik elementin varlığını ortaya çıkarma yeteneği genellikle çözeltinin^{yoğunluğu ile belirlenir 20}.

Önceki raporlar, köpek nematod yumurtalarının tespiti için koproparazitolojik teknikleri karşılaştırmıştır. Hareketli protozoaların tespiti ile ilgili olarak, doğrudan dışkı yaymaları kullanılır; Sedimantasyon yöntemleri ise trematodlar gibi parazitlerin ağır yumurtalarını teşhis etmek için yararlıdır²¹. En yaygın kullanılan alan bazlı tanı testlerinden biri fekal smear yöntemidir. Bununla birlikte, bu tekniğin düşük hassasiyet seviyesi, parazit yumurtalarının tespitine müdahale eden döküntüler içermesine bağlanabilir. Uygun SpG’yi sağlayan çözümlerle birlikte bir eleme adımını dahil ederek, yüzdürme yöntemi, ascarid ve kancalı kurt yumurtalarının daha net ve daha az karmaşık bir gözlemini sunar. Bu, mikroskobik tarama için daha hassas ve verimli bir sürece yol açar²². Benzer şekilde, parazit yumurtalarını ve ookistlerini geri kazanmak için basit yüzdürme ve doğrudan santrifüj yüzdürme teknikleri çok yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁴. Klasik yüzdürme yöntemleri, McMaster yöntemi¹⁵ gibi bir sayma odasının kullanımına bağlı olarak kalitatif veya kantitatif olarak kabul edilebilir. Bununla birlikte, yüzdürme tekniğinin duyarlılığı düşük olduğundan ve patent döneminde parazitlerin tespitine odaklandığından, olumsuz sonuçlar kesin olarak kabul edilmemelidir. Bununla birlikte, doğruluk sadece dışkı örneklerinin koruma prosedürüne veya yüzdürme çözeltilerinin SpG’sine bağlı değildir, aynı zamanda kullanıcının dışkı muayenelerini yapmadaki teknik yeterliliğine ve deneyimine de bağlıdır.

Sonuç olarak, dışkıdaki köpek parazitlerinin tespiti için başka yöntemler araştırılmıştır. Köpeklerde bağırsak helmint enfeksiyonlarının teşhisi için en yaygın kullanılan yaklaşımlardan birinin, bir tüpteki yüzdürme protokolü ve McMaster tekniği ile karşılaştırıldığında köpeklerde A. caninum tanısı için doğru ve güvenilir sonuçlar veren çok değerli, hassas ve doğru bir yöntem olan FLOTAC tekniği olduğu genel olarak kabul edilmiştir^{19, 23}. Sedimantasyon yöntemleri, fluke yumurtalarının, embriyonlu nematod yumurtalarının ve çoğu tenya yumurtasının geri kazanılması için kullanışlıdır, bu yapılar yüzmediği için bir yüzdürme çözeltisinin yüzeyinde geri kazanılamaz²⁴. Yüzdürme/sedimantasyon tekniklerinden daha üstün olduğu kanıtlanmış bir yöntem, dışkıda sestod yumurtalarının saptanmasını sağladığı, daha az zaman aldığı, Anoplocephala yumurtalarını dışkı kalıntılarından ayırdığı ve kristalleşmeyi azalttığı için Modifiye Çift Santrifüj Flotasyon yöntemidir²⁵. Ayrıca, bu teknik, yüksek hassasiyete sahip ascarid yumurtalarını tespit etmek için başarıyla kullanılmıştır²⁶. Yine de, yukarıda bahsedilen bu tekniklerden bazıları ve Ovassay gibi santrifüj yöntemleri, bu çalışmada önerdiğimiz yüzdürme protokolünün aksine, formalin, ticari kitler, laboratuvar koşullarında numune işleme gibi reaktiflerde numune muhafazasını ve çinko sülfat²⁷ gibi pahalı olan ve çevresel toksisiteyi önlemek için özel imha prosedürleri gerektiren reaktiflerin kullanılmasını gerektirir.

Yüksek SpG’li solüsyonlar ekleyerek flotasyon yönteminin hassasiyetini arttıran tekniklerin kullanılması son zamanlarda tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bu çözümlerin dezavantajının, son preparasyonda döküntülerin artması ve dolayısıyla parazit yumurtalarının yanlış tespiti olduğu düşünülmelidir. Ek olarak, malzemelerin, reaktiflerin ticari mevcudiyeti, maliyet, çevresel etki sorunları ve santrifüj yöntemlerinin kullanım zorluğu, bu çalışmada sunduğumuz protokolün aksine saha koşullarında zor olabilen bir yüzdürme tekniğinin¹⁴ seçimini etkiler. Yüzdürme çözeltilerinin sofra tuzu ile hazırlanması şeker kullanımına göre avantajlıdır çünkü tarla koşullarında şeker, yaban arısı ve arı gibi böcekleri çeker ve müstahzarlar yapışkan hale gelir. Ayrıca, yapışkanlığı önlemek için şeker çözeltilerine eklenen fenol veya ZnS04 gibi çözeltiler, çevre koruma yönergelerine göre uygun şekilde atılmak için karmaşıktır ve sahada atılamaz; sofra tuzu çözeltisinin aksine.

Bu makalenin amacı, tarla ve laboratuvar koşullarında basit yüzdürme tekniğinin bir uyarlamasını kullanarak dışkı örneklerinde T. canis ve Ancylostoma spp. yumurtalarını tespit etme adımlarını göstermektir. Burada açıklanan protokolü takiben ve yedek pilli bir mikroskop kullanarak, kırsal ve banliyö alanlarında bu köpek zoonotik parazitlerinin teşhisi, laboratuvar ekipmanı ve altyapısı mevcut olmadığında mümkündür. Bu çalışmada açıklanan basit yüzdürme yöntemi hızlı sonuçlar sağlayabilir ve rutin tarama için non-invaziv ve uygun maliyetli bir tekniktir.