שיטת הנפקה צואה פשוטה לאבחון נמטודות זואונוטיות בתנאי שדה ומעבדה

טפילים במערכת העיכול הם אחת הבעיות הבריאותיות הנפוצות ביותר המשפיעות על כלבים¹. הערכות מצביעות על כך שישנם ~700 מיליון כלבים מבויתים ברחבי העולם, וכ -175 מיליון עשויים להיות מסווגים כמשוטטים חופשיים². יותר מ-60 מיני טפילים משותפים לכלבים ולבני אדם, מה שמרמז על כך שכלבים יכולים להיות מקור להדבקה של בני אדם בטפילים אלה³. Toxocara canis ו– Ancylostoma caninum הם שני מינים טפיליים שמדביקים כלבים, ובטעות, פונדקאים אנושיים. נכון לעכשיו, ישנם מספר מחקרים על המקומות שבהם הלמינת’ס אלה מסוגלים לשרוד ולהתרבות במקסיקו. שכיחות הטוקסוקרה בכלבים נעה בין 0% ליותר מ-87% ברחבי ארצות הברית, מקסיקו, מרכז אמריקה והקריביים⁴. Toxocara canis ו– Ancylostoma spp., כמו גם מינים טפיליים אחרים בכלבים, דווחו בעבר במקסיקו 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (טבלה 1 ).

טבלה 1: שכיחות אזורית (%) של טפילי כלבים במקסיקו בין השנים 2001 ל-2020. ממצאים מחקירות קודמות שנערכו בין השנים 2001 ל-2020 אפשרו זיהוי של תפוצת טפילי כלבים במספר סביבות עירוניות וכפריות במקסיקו. מחקרים אלה מספקים הבנה מעמיקה של אלמנטים אפידמיולוגיים התורמים להתמדה של טפילי כלבים במערכות אקולוגיות שונות, ותורמים להערכה מקיפה של ההשפעה הזואונוטית של כמה מיני טפילים.

שלבי מחזור החיים של טפילי מעיים, כגון ביצים, ציסטות, ביציות או זחלים ניתן למצוא בדגימות צואה. לכן, בדיקה של חומר צואה מספק מידע רב ערך על טפילים של חיה. הצורך בשיטה לאיתור ביצי Ancylostomidae בצואת אדם הוביל לשימוש בכתם צואה פשוט בשנת 1878, ששימש במשך שנים רבות לאיתור טפילים במערכת העיכול אך נחשב לא רגיש במיוחד. לפיכך, התעורר הצורך לפתח שיטות קופרומיקרוסקופיות טובות יותר¹⁴. יותר מ-100 שנים חלפו מאז תוארה לראשונה טכניקת ההנפקה לשחזור וספירת ביצי טפילים בדגימות צואה¹⁵. מאז, מספר שיטות ווריאנטים של טכניקת ההנפקה נחשבו תקן לאיתור טפילים מסוימים אצל המארחים שלהם.

לדוגמה, ליין תיאר שיטה בשנת 1924 הכוללת את טכניקת ההנפקה הצנטריפוגלית הישירה, המשלבת צנטריפוגה ואחריה הצפת המשקעים בתמיסת נתרן כלורי רוויה עם SpG 1.2 ב 1 גרם (ליין) או 10 גרם (שינוי של סטול). טכניקת ההנפקה שונתה לאחר מכן על ידי שימוש בתמיסות עם SpG¹⁴ שונה. בשנת 1939 דיווחו גורדון וויטלוק על חסרונות הטכניקה של סטול עקב התערבות של דטריטוס בהדמיה של ביצי טפילים ופיתחו את השיטה הכמותית הידועה בשם מקמאסטר¹⁶. בשנת 1979 הראו או’גריידי וסלוקומב כי הכובד הסגולי של התמיסה, התזמון וגדלי הרשת של המסננות משפיעים על דיוק זיהוי הביצים באמצעות טכניקת ההנפקה¹⁷. במהלך העשורים האחרונים, מכיוון שנעשו מספר שינויים בטכניקת ההנפקה, יש צורך דחוף בסטנדרטיזציה של שיטות ההנפקה. כיום, זיהוי של זיהומי הלמינת’ס כלביים בהקשר של מניעת טפילים זואונוטיים נדרש ליישם טיפולים אנטלמינטיים מתאימים כדי להגביל זיהום סביבתי עם שלבים זיהומיים של נמטודות זואונוטיות¹⁸.

בין השיטות האיכותיות, טכניקת הנפקת הצואה נמצאת בשימוש נרחב ומקובל מכיוון שהיא אינה דורשת ציוד רב, היא פשוטה, זולה וניתנת לשחזור; עם זאת, יש לו חיסרון גדול בכך שהוא חסר רגישות כאשר עוצמת הזיהום נמוכה¹⁹. היכולת לחשוף את נוכחותם של מספר רב יותר של אלמנטים טפיליים כגון ביצים, ביציות, ציסטות או זחלי נמטודה נקבעת בדרך כלל על ידי צפיפות התמיסה²⁰.

דיווחים קודמים השוו טכניקות קו-פרזיטולוגיות לזיהוי ביצי נמטודות כלבים. לגבי זיהוי של פרוטוזואה תנועתית, מריחות צואה ישירות משמשים; ואילו שיטות שיקוע שימושיות לאבחון ביצים כבדות של טפילים כגון טרמטודות²¹. אחת מבדיקות האבחון מבוססות השטח הנפוצות ביותר היא שיטת מריחת הצואה. עם זאת, ניתן לייחס את רמת הרגישות הנמוכה של טכניקה זו לעובדה שהיא מכילה פסולת המפריעה לאיתור ביצי טפילים. על ידי שילוב שלב מסננת יחד עם פתרונות המספקים את ה- SpG הנכון, שיטת ההנפקה מציעה התבוננות ברורה יותר ופחות עמוסה בביצי אסקרידים ותולעי קרס. זה מוביל לתהליך מדויק ויעיל יותר לסינון מיקרוסקופי²². כמו כן, טכניקות הנפקה פשוטות וצנטריפוגליות ישירות משמשות בדרך כלל לשחזור ביצי טפילים וביציות¹⁴. שיטות ההנפקה הקלאסיות יכולות להיחשב איכותיות או כמותיות בהתאם לשימוש בתא ספירה כגון שיטת מקמאסטר¹⁵. עם זאת, מכיוון שטכניקת ההנפקה היא בעלת רגישות נמוכה ומתמקדת באיתור טפילים בתקופת הפטנט, אין לראות בתוצאות שליליות חד משמעיות. עם זאת, הדיוק לא רק תלוי בהליך השימור של דגימות צואה או SpG של פתרונות ציפה, אלא גם תלוי במיומנות טכנית וניסיון בביצוע בדיקות צואה של המשתמש.

כתוצאה מכך, שיטות אחרות נחקרו לאיתור טפילים כלבים בצואה. ידוע כי אחת הגישות הנפוצות ביותר לאבחון זיהומי הלמינת’ס במעיים בכלבים היא טכניקת FLOTAC, שיטה רב-ערכית, רגישה ומדויקת המניבה תוצאות מדויקות ואמינות לאבחון A. caninum בכלבים בהשוואה לפרוטוקול הנפקה בצינור וטכניקת מקמאסטר^{19, 23}. שיטות שיקוע שימושיות לשחזור ביצי פלוק, ביצי נמטודות עובריות ורוב ביצי תולעי הסרט, שלא ניתן לשחזר על פני תמיסת הנפקה מכיוון שמבנים אלה אינם צפים²⁴. שיטה אחת שהוכחה כעדיפה על טכניקות הנפקה/שיקוע היא שיטת ההנפקה הצנטריפוגלית הכפולה המותאמת, שכן היא מאפשרת איתור ביצי צסטודה בצואה, גוזלת פחות זמן, מפרידה ביצי אנופלוצפלה מפסולת צואה ומפחיתה התגבשות²⁵. יתר על כן, טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי לזהות ביצים ascarid עם רגישות גבוהה²⁶. עם זאת, חלק מהטכניקות והשיטות הצנטריפוגליות הנ”ל כגון Ovassay, בניגוד לפרוטוקול ההנפקה שאנו מציעים במחקר זה, דורשות שימור דגימות בריאגנטים כגון פורמלין, ערכות מסחריות, עיבוד דגימות בתנאי מעבדה, ושימוש בריאגנטים כגון אבץ גופרתי²⁷ שהם יקרים ודורשים הליכי סילוק מיוחדים כדי למנוע רעילות סביבתית.

השימוש בטכניקות המגבירות את הרגישות של שיטת ההנפקה על ידי הוספת פתרונות עם SpG גבוה מועדף לאחרונה. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי החיסרון של פתרונות אלה הוא הגידול בפסולת בהכנה הסופית ומכאן, גילוי לא מדויק של ביצים טפיל. בנוסף, הזמינות המסחרית של חומרים, ריאגנטים, עלות, בעיות השפעה על הסביבה וקושי בשימוש בשיטות צנטריפוגליות משפיעים על בחירת טכניקת הנפקה¹⁴, שיכולה להיות מאתגרת בתנאי שטח בניגוד לפרוטוקול שאנו מציגים בעבודה זו. להכנת תמיסות ההנפקה במלח שולחן יש יתרון על פני ניצול הסוכר מכיוון שבתנאי שדה סוכר מושך חרקים כמו צרעות ודבורים והתכשירים הופכים לדביקים. יתר על כן, פתרונות כגון פנול, אשר מתווסף לתמיסות סוכר כדי למנוע דביקות, או ZnSO₄מורכבים להשלכה כראוי על פי הנחיות הגנת הסביבה ולא ניתן להיפטר מהם בשטח; בניגוד לתמיסת מלח שולחן.

מטרת כתב היד היא להדגים את השלבים לגילוי ביציות T. canis ו – Ancylostoma spp. בדגימות צואה תוך התאמה של טכניקת ההנפקה הפשוטה בתנאי שדה ומעבדה. בהתאם לפרוטוקול המתואר כאן ובאמצעות מיקרוסקופ עם סוללת גיבוי, אבחון של טפילים זואונוטיים כלביים אלה באזורים כפריים ופרבריים אפשרי כאשר אין ציוד מעבדה ותשתיות זמינים. שיטת ההנפקה הפשוטה המתוארת בעבודה זו יכולה לספק תוצאות מהירות והיא טכניקה לא פולשנית וחסכונית לבדיקות סקר שגרתיות.