Простой метод фекальной флотации для диагностики зоонозных нематод в полевых и лабораторных условиях

Желудочно-кишечные паразиты являются одной из наиболее распространенных проблем со здоровьем, которые поражают собак¹. По оценкам, во всем мире насчитывается ~700 миллионов домашних собак, и примерно 175 миллионов из них могут быть отнесены к категории свободно^{гуляющих.} Более 60 видов паразитов являются общими для собак и людей, что позволяет предположить, что собаки могут быть источником инфекции для людей этими^{паразитами.} Toxocara canis и Ancylostoma caninum — два паразитических вида, которые заражают собак и, случайно, людей-хозяев. В настоящее время существует несколько исследований о местах, где эти гельминты способны выживать и размножаться в Мексике. Распространенность токсокары у собак колеблется от 0% до более чем 87% в США, Мексике, Центральной Америке и странах Карибского бассейна⁴. Toxocara canis и Ancylostoma spp., а также другие виды паразитов у собак ранее были зарегистрированы в Мексике 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (табл. 1).

Таблица 1: Региональная распространенность (%) паразитов собак в Мексике с 2001 по 2020 гг. Результаты предыдущих исследований, проведенных с 2001 по 2020 год, позволили выявить распространение собачьих паразитов в нескольких городских и сельских районах Мексики. Эти исследования обеспечивают глубокое понимание эпидемиологических элементов, способствующих персистенции собачьих паразитов в различных экосистемах, способствуя комплексной оценке зоонозного воздействия некоторых видов паразитов.

Стадии жизненного цикла кишечных паразитов, таких как яйца, цисты, ооцисты или личинки, могут быть обнаружены в образцах стула. Таким образом, исследование фекального материала дает ценную информацию о паразитах животного. Потребность в методе обнаружения яиц Ancylostomidae в фекалиях человека привела к тому, что в 1878 году был использован простой мазок кала, который в течение многих лет использовался для обнаружения желудочно-кишечных паразитов, но считался не очень чувствительным. Таким образом, возникла необходимость в разработке более совершенных копромикроскопических методов¹⁴. Прошло более 100 лет с тех пор, как была впервые описана флотационная методика извлечения и подсчета яиц паразитов в образцах фекалий¹⁵. С тех пор несколько методов и вариантов флотационной техники считаются стандартными для обнаружения некоторых паразитов в их хозяевах.

Например, в 1924 году Лейн описал метод, включающий метод прямой центробежной флотации, который включает центрифугирование с последующим всплытием осадка в насыщенном растворе хлорида натрия с SpG 1,2 в 1 г (Лейн) или 10 г (модификация Столла). Впоследствии метод флотации был модифицирован за счет использования растворов с различными SpG¹⁴. В 1939 году Гордон и Уитлок сообщили о недостатках метода Столла из-за помех от детрита при визуализации яиц паразитов и разработали количественный метод, известный как McMaster¹⁶. В 1979 г. О’Грэйди и Слокомб продемонстрировали, что удельный вес раствора, время и размеры ячеек сетчатых фильтров влияют на точность обнаружения яиц с помощью метода флотации¹⁷. В последние десятилетия в связи с тем, что в технику флотации был внесен ряд изменений, возникла острая необходимость в стандартизации методов флотации. В настоящее время выявление гельминтозов собак в контексте профилактики зоонозных паразитов требует применения соответствующих антигельминтных препаратов для ограничения загрязнения окружающей среды инфекционными стадиями зоонозных нематод¹⁸.

Среди качественных методов широко используется и принимается метод фекальной флотации, поскольку он не требует большого количества оборудования, прост, недорог и воспроизводим; Тем не менее, у него есть существенный недостаток, заключающийся в том, что ему не хватает чувствительности при низкой интенсивности инфекции¹⁹. Способность выявлять наличие большего числа паразитарных элементов, таких как яйца, ооцисты, цисты или личинки нематод, обычно определяется плотностью раствора²⁰.

В предыдущих отчетах сравнивались копропаразитологические методы обнаружения яиц собачьей нематоды. Что касается выявления подвижных простейших, то используют прямые мазки кала; В то время как методы седиментации полезны для диагностики тяжелых яиц паразитов, таких как трематоды²¹. Одним из наиболее широко используемых полевых диагностических тестов является метод мазка кала. Однако низкий уровень чувствительности этого метода можно объяснить тем, что он содержит мусор, который мешает обнаружению яиц паразитов. Благодаря включению этапа просеивания вместе с растворами, обеспечивающими надлежащий SpG, метод флотации обеспечивает более четкое и менее загроможденное наблюдение за яйцами аскарид и анкилостомоз. Это приводит к более точному и эффективному процессу микроскопического скрининга²². Кроме того, для извлечения яиц паразитов и ооцист очень часто используются методы простой флотации и прямой центробежной флотации¹⁴. Классические методы флотации можно считать качественными или количественными в зависимости от использования счетной камеры, такой как метод Макмастера¹⁵. Тем не менее, поскольку метод флотации имеет низкую чувствительность и ориентирован на обнаружение паразитов в период действия патента, отрицательные результаты не следует считать окончательными. Однако точность зависит не только от процедуры консервации образцов фекалий или SpG флотационных растворов, но и от технической квалификации и опыта проведения фекальных исследований пользователя.

Следовательно, были изучены другие методы обнаружения собачьих паразитов в фекалиях. Общепризнано, что одним из наиболее широко используемых подходов к диагностике кишечных гельминтозов у собак является метод FLOTAC, поливалентный, чувствительный и точный метод, который дает точные и надежные результаты для диагностики A. caninum у собак по сравнению с протоколом флотации в пробирке и методом Макмастера^{19. 23}. См. Методы седиментации полезны для извлечения яиц сосальщиков, эмбриональных яиц нематод и большинства яиц ленточных червей, которые не могут быть извлечены на поверхности флотационного раствора, поскольку эти структуры не всплывают²⁴. Одним из методов, который, как было доказано, превосходит методы флотации/седиментации, является модифицированный метод двойной центробежной флотации, поскольку он позволяет обнаруживать цестодные яйца в фекалиях, занимает меньше времени, отделяет яйца Anoplocephala от фекальных остатков и снижает кристаллизацию²⁵. Более того, эта методика успешно используется для обнаружения яиц аскарид с высокой чувствительностью²⁶. Тем не менее, некоторые из этих вышеупомянутых методов и центробежных методов, таких как Ovassay, в отличие от протокола флотации, который мы предлагаем в этом исследовании, требуют консервации образцов в реагентах, таких как формалин, коммерческие наборы, обработки образцов в лабораторных условиях и использования реагентов, таких как сульфат цинка²⁷, которые являются дорогостоящими и требуют специальных процедур утилизации, чтобы избежать токсичности для окружающей среды.

В последнее время предпочтение отдается методам, повышающим чувствительность флотационного метода путем добавления растворов с высоким SpG. Однако необходимо учитывать, что недостатком этих растворов является увеличение мусора в конечном приготовлении и, следовательно, неточное обнаружение яиц паразитов. Кроме того, коммерческая доступность материалов, реагентов, стоимость, вопросы воздействия на окружающую среду и сложность использования центробежных методов влияют на выбор метода флотации¹⁴, который может быть сложным в полевых условиях в отличие от протокола, который мы представляем в этой работе. Приготовление флотационных растворов с поваренной солью имеет преимущество перед утилизацией сахара, так как в полевых условиях сахар привлекает насекомых, таких как осы и пчелы, и препараты становятся липкими. Кроме того, такие растворы, как фенол, который добавляется в растворы сахара, чтобы избежать липкости, или ZnSO₄, сложно правильно утилизировать в соответствии с рекомендациями по охране окружающей среды, и их нельзя утилизировать в полевых условиях; В отличие от раствора поваренной соли.

Целью данной статьи является демонстрация этапов обнаружения яиц T. canis и Ancylostoma spp. в образцах фекалий с использованием адаптации простого флотационного метода в полевых и лабораторных условиях. В соответствии с описанным протоколом и с использованием микроскопа с резервным аккумулятором диагностика этих зоонозных паразитов собак в сельской и пригородной местности возможна при отсутствии лабораторного оборудования и инфраструктуры. Простой метод флотации, описанный в этой работе, может обеспечить быстрые результаты и является неинвазивным и экономически эффективным методом рутинного скрининга.