Un semplice metodo di flottazione fecale per la diagnosi di nematodi zoonotici in condizioni di campo e di laboratorio

I parassiti gastrointestinali sono uno dei problemi di salute più comuni che colpiscono i cani¹. Le stime suggeriscono che ci sono ~ 700 milioni di cani domestici in tutto il mondo e circa 175 milioni possono essere classificati come free-roaming². Più di 60 specie di parassiti sono condivise tra cani ed esseri umani, suggerendo che i cani potrebbero essere una fonte di infezione per gli esseri umani con questi parassiti³. Toxocara canis e Ancylostoma caninum sono due specie parassitarie che infettano i cani e, accidentalmente, gli ospiti umani. Attualmente, ci sono diversi studi sui luoghi in cui questi elminti sono in grado di sopravvivere e riprodursi in Messico. La prevalenza di Toxocara nei cani varia dallo 0% a oltre l’87% negli Stati Uniti, in Messico, in America Centrale e nei Caraibi⁴. Toxocara canis e Ancylostoma spp., così come altre specie parassitarie nei cani, sono state precedentemente segnalate in Messico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabella 1).

Tabella 1: Prevalenza regionale (%) dei parassiti del cane in Messico dal 2001 al 2020. I risultati di precedenti indagini condotte dal 2001 al 2020 hanno permesso di identificare la distribuzione dei parassiti canini in diversi contesti urbani e rurali in Messico. Questi studi forniscono una profonda comprensione degli elementi epidemiologici che favoriscono la persistenza dei parassiti canini in diversi ecosistemi, contribuendo a una valutazione completa dell’impatto zoonotico di alcune specie di parassiti.

Le fasi del ciclo di vita dei parassiti intestinali, come uova, cisti, oocisti o larve, possono essere trovate in campioni di feci. Pertanto, l’esame del materiale fecale fornisce informazioni preziose sui parassiti di un animale. La necessità di un metodo per rilevare le uova di Ancylostomidae nelle feci umane ha portato all’uso del semplice striscio fecale nel 1878, che è stato utilizzato per molti anni per rilevare i parassiti gastrointestinali ma è stato considerato poco sensibile. Da qui è emersa la necessità di sviluppare metodi copromicroscopici migliori¹⁴. Sono passati più di 100 anni da quando è stata descritta per la prima volta la tecnica di flottazione per il recupero e il conteggio delle uova di parassita nei campioni fecali¹⁵. Da allora, diversi metodi e varianti della tecnica di flottazione sono stati considerati uno standard per il rilevamento di alcuni parassiti nei loro ospiti.

Ad esempio, Lane descrisse un metodo nel 1924 che coinvolgeva la tecnica di flottazione centrifuga diretta, che integra la centrifugazione seguita dal galleggiamento del sedimento in una soluzione satura di cloruro di sodio con SpG 1,2 in 1 g (Lane) o 10 g (modifica di Stoll). La tecnica di flottazione è stata successivamente modificata utilizzando soluzioni con diversi SpG¹⁴. Nel 1939, Gordon e Whitlock riportarono gli svantaggi della tecnica di Stoll a causa dell’interferenza dei detriti nella visualizzazione delle uova del parassita e svilupparono il metodo quantitativo noto come McMaster¹⁶. Nel 1979, O’Grady e Slocombe dimostrarono che il peso specifico della soluzione, la tempistica e le dimensioni delle maglie dei filtri influenzano l’accuratezza del rilevamento delle uova utilizzando la tecnica di flottazione¹⁷. Negli ultimi decenni, poiché sono state apportate diverse modifiche alla tecnica di flottazione, c’è un urgente bisogno di standardizzare i metodi di flottazione. Attualmente, il rilevamento delle infezioni da elminti canini nel contesto della prevenzione dei parassiti zoonotici è necessario per applicare trattamenti antielmintici appropriati per limitare la contaminazione ambientale con stadi infettivi di nematodi zoonotici¹⁸.

Tra i metodi qualitativi, la tecnica di flottazione fecale è ampiamente utilizzata e accettata perché non richiede molta attrezzatura, è semplice, economica e riproducibile; Tuttavia, ha un grosso svantaggio in quanto manca di sensibilità quando l’intensità dell’infezione è bassa¹⁹. La capacità di rivelare la presenza di un maggior numero di elementi parassiti come uova, oocisti, cisti o larve di nematodi è solitamente determinata dalla densità della soluzione²⁰.

Rapporti precedenti hanno confrontato le tecniche coproparassitologiche per il rilevamento delle uova di nematodi canini. Per quanto riguarda l’individuazione dei protozoi mobili, si ricorre a strisci fecali diretti; mentre i metodi di sedimentazione sono utili per diagnosticare uova pesanti di parassiti come i trematodi²¹. Uno dei test diagnostici sul campo più utilizzati è il metodo dello striscio fecale. Tuttavia, il basso livello di sensibilità di questa tecnica può essere attribuito al fatto che contiene detriti che interferiscono con il rilevamento delle uova del parassita. Incorporando una fase di setacciatura insieme a soluzioni che forniscono il corretto SpG, il metodo di flottazione offre un’osservazione più chiara e meno ingombrante delle uova di ascaridi e anchilostomi. Ciò porta a un processo più preciso ed efficiente per lo screening microscopico²². Allo stesso modo, le tecniche di flottazione semplice e centrifuga diretta sono molto comunemente utilizzate per recuperare uova e oocisti parassite¹⁴. I metodi di flottazione classici possono essere considerati qualitativi o quantitativi a seconda dell’utilizzo di una camera di conteggio come il metodo McMaster¹⁵. Tuttavia, poiché la tecnica di flottazione ha una bassa sensibilità e si concentra sull’individuazione di parassiti nel periodo di brevetto, i risultati negativi non dovrebbero essere considerati conclusivi. Tuttavia, l’accuratezza non dipende solo dalla procedura di conservazione dei campioni fecali o dalla SpG delle soluzioni di flottazione, ma dipende anche dalla competenza tecnica e dall’esperienza nell’esecuzione di esami fecali dell’utente.

Di conseguenza, sono stati esplorati altri metodi per il rilevamento di parassiti canini nelle feci. È stato generalmente riconosciuto che uno degli approcci più utilizzati per la diagnosi delle infezioni intestinali da elminti nei cani è la tecnica FLOTAC, un metodo polivalente, sensibile e accurato che fornisce risultati accurati e affidabili per la diagnosi di A. caninum nei cani rispetto a un protocollo di galleggiamento in provetta e alla tecnica McMaster^{19, 23}. I metodi di sedimentazione sono utili per recuperare le uova di trematode, le uova di nematodi embrionati e la maggior parte delle uova di tenia, che non possono essere recuperate sulla superficie di una soluzione di flottazione perché queste strutture non galleggiano²⁴. Un metodo che si è dimostrato superiore alle tecniche di flottazione/sedimentazione è il metodo di flottazione a doppia centrifuga modificata, in quanto consente di rilevare le uova di cestodi nelle feci, è meno dispendioso in termini di tempo, separa le uova di Anoplocephala dai detriti fecali e riduce la cristallizzazione²⁵. Inoltre, questa tecnica è stata utilizzata con successo per rilevare uova ascaridi con elevata sensibilità²⁶. Tuttavia, alcune di queste tecniche e metodi centrifughi come l’Ovassay, al contrario del protocollo di flottazione che proponiamo in questo studio, richiedono la conservazione del campione in reagenti come la formalina, kit commerciali, l’elaborazione del campione in condizioni di laboratorio e l’uso di reagenti come il solfato di zinco²⁷ che sono costosi e richiedono speciali procedure di smaltimento per evitare la tossicità ambientale.

Recentemente è stato favorito l’uso di tecniche che aumentano la sensibilità del metodo di flottazione aggiungendo soluzioni ad alto SpG. Tuttavia, bisogna considerare che lo svantaggio di queste soluzioni è l’aumento dei detriti nella preparazione finale e quindi il rilevamento impreciso delle uova del parassita. Inoltre, la disponibilità commerciale di materiali, reagenti, costi, problemi di impatto ambientale e difficoltà di utilizzo dei metodi centrifughi influenzano la selezione di una tecnica di flottazione¹⁴, che può essere impegnativa in condizioni di campo in contrasto con il protocollo che presentiamo in questo lavoro. La preparazione delle soluzioni di flottazione con sale da cucina è vantaggiosa rispetto all’utilizzo dello zucchero perché in condizioni di campo, lo zucchero attira insetti come vespe e api e le preparazioni diventano appiccicose. Inoltre, soluzioni come il fenolo, che viene aggiunto alle soluzioni zuccherine per evitare l’appiccicosità, o lo ZnSO₄sono complesse da scartare correttamente secondo le linee guida sulla protezione ambientale e non possono essere smaltite sul campo; a differenza di una soluzione di sale da cucina.

L’obiettivo di questo manoscritto è quello di dimostrare i passaggi per rilevare le uova di T. canis e Ancylostoma spp. in campioni fecali utilizzando un adattamento della tecnica di flottazione semplice in condizioni di campo e di laboratorio. Seguendo il protocollo qui descritto e utilizzando un microscopio con una batteria di riserva, la diagnosi di questi parassiti zoonotici canini nelle aree rurali e suburbane è possibile quando non sono disponibili attrezzature e infrastrutture di laboratorio. Il semplice metodo di flottazione descritto in questo lavoro può fornire risultati rapidi ed è una tecnica non invasiva ed economica per lo screening di routine.