Lo studio descrive un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per isolare nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento dell’RNA di singoli nuclei a valle.
Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula e a singolo nucleo è diventato un’applicazione comune in laboratorio grazie alla ricchezza di informazioni trascrittomiche che fornisce. Il sequenziamento dell’RNA a nucleo singolo, in particolare, è utile per studiare l’espressione genica in tessuti difficili da dissociare. Inoltre, questo approccio è compatibile anche con il materiale congelato (d’archivio). In questo articolo, descriviamo un protocollo per isolare singoli nuclei di alta qualità da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento a valle dell’RNA di un singolo nucleo in modo parzialmente automatizzato utilizzando strumenti e reagenti disponibili in commercio. In particolare, viene utilizzato un dissociatore robotico per automatizzare e standardizzare l’omogeneizzazione dei tessuti, seguito da un gradiente chimico ottimizzato per filtrare i nuclei. Infine, contiamo in modo accurato e automatico i nuclei utilizzando un contatore di cellule fluorescente automatizzato. Le prestazioni di questo protocollo sono dimostrate sul cervello di topo, sul rene di ratto e sul tessuto epatico e milza di cynomolgus. Questo protocollo è semplice, rapido e facilmente adattabile a vari tessuti di mammiferi senza richiedere un’ampia ottimizzazione e fornisce nuclei di buona qualità per il sequenziamento dell’RNA di singoli nuclei a valle.
Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (sc) e a singolo nucleo (sn) è diventato un protocollo comunemente usato in biologia molecolare e cellulare a causa della maggiore risoluzione dell’espressione genica rispetto al sequenziamento di massa dell’RNA. Tuttavia, l’isolamento di preparazioni di buona qualità a singola cellula e a singolo nucleo da tessuti solidi rimane una sfida ed è spesso la fase limitante negli esperimenti sc/sn-RNAseq. Infatti, è stata sviluppata una pletora di protocolli che utilizzano varie procedure chimiche e meccaniche per ottenere sospensioni cellulari/nucleiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Inoltre, le strategie per ripulire tali preparati da detriti/grumi, ecc., vanno dalla cernita del flusso alla filtrazione al lavaggio. Tali protocolli sono spesso manuali (con conseguente variabilità correlata all’utente), possono richiedere molto tempo (con conseguente riduzione della vitalità cellulare/nucleo) e/o possono richiedere l’accesso a un citometro a flusso per l’ordinamento di cellule/nuclei. Questo studio si è concentrato sullo sviluppo di un protocollo di isolamento di singoli nuclei semplice, rapido e parzialmente automatizzato da tessuti di mammiferi congelati per applicazioni di sequenziamento dell’RNA a valle. Ci siamo concentrati in particolare sull’isolamento dei nuclei rispetto all’isolamento cellulare in quanto è compatibile con l’uso di tessuti congelati, rendendo più pratica la raccolta/elaborazione dei campioni e consentendo un dosaggio imparziale dei campioni, specialmente negli esperimenti a tempo determinato. Inoltre, sebbene il trascrittoma nucleare non rifletta completamente il trascrittoma cellulare, diversi studi hanno ora dimostrato che i dati di sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo sono paragonabili ai dati di sequenziamento dell’RNA a singola cellula per l’identificazione del tipo di cellula, anche se le proporzioni dei tipi di cellule possono variare 6,16,17,18,19.
L’isolamento dei nuclei consiste in diverse fasi: 1) disgregazione meccanica o chimica del tessuto per rilasciare i nuclei, 2) pulizia di detriti e grumi e 3) conteggio accurato dei nuclei per la preparazione per le applicazioni a valle. In un certo numero di protocolli, la fase 1 prevede spesso l’uso di un omogeneizzatore Dounce per distruggere il tessuto 3,20. In alternativa, possono essere utilizzati metodi chimici, anche se spesso devono essere ottimizzati per tessuti diversi 2,5,6. Abbiamo sperimentato che una procedura manuale di disgregazione tissutale è soggetta a variabilità associata all’operatore, portando a una qualità e a una resa dei nuclei variabili. Al fine di ridurre al minimo la variabilità tecnica e di avere un protocollo più coerente e riproducibile che funzioni su tutti i tessuti, è stato sviluppato un protocollo che utilizza un dissociatore tissutale robotico disponibile in commercio21. Per la fase 2, sebbene lo scambio di tamponi sia di solito il mezzo più semplice per lavare i nuclei, abbiamo adottato l’uso di una fase di centrifugazione a gradiente di saccarosio relativamente breve per avere una rimozione più completa dei detriti. Per il tessuto cerebrale in particolare, utilizziamo un gradiente colloidale di silice invece di un gradiente di saccarosio per una rimozione più efficace della mielina. Infine, per il conteggio, l’uso di un emocitometro è il gold standard per il conteggio e l’ispezione visiva dei nuclei. Nel nostro protocollo, questa fase può essere automatizzata in modo affidabile utilizzando un contatore di cellule fluorescenti automatizzato disponibile in commercio22. Questo protocollo è stato testato ed è compatibile con diversi tessuti congelati di mammiferi, tra cui cervello, rene, milza e fegato, di diverse specie di mammiferi (ratto, topo e primate non umano) e fornisce nuclei di buona qualità per il sequenziamento dell’RNA di singoli nuclei a valle con una piattaforma commerciale basata su goccioline. Il protocollo impiega circa 75 minuti dalla preparazione del tessuto all’inizio del flusso di lavoro di sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo.
Abbiamo sviluppato un protocollo versatile e parzialmente automatizzato per ottenere singoli nuclei di alta qualità da tessuti congelati di mammifero e abbiamo dimostrato il protocollo su cervello di topo, rene di ratto e tessuto epatico e milza di cynomolgus.
Confrontando le prestazioni di questo protocollo con quelle di altri protocolli pubblicati per il sequenziamento dell’RNA a nucleo singolo nel cervello, nei reni, nella milza e nel tessuto epatico 6,7,20,24,25,26, osserviamo che siamo in grado di rilevare un numero simile di geni e conteggi UMI per nucleo e siamo in grado di recuperare i tipi di cellule attesi. Rispetto ai metodi esistenti, questo protocollo presenta diversi vantaggi. In primo luogo, il protocollo in questo studio automatizza l’omogeneizzazione dei tessuti e l’isolamento dei singoli nuclei. Ciò si ottiene con l’uso di un disgregatore tissutale robotico21. Nella maggior parte dei protocolli, il tessuto viene omogeneizzato con un omogeneizzatore Dounce per liberare i singoli nuclei 3,20. Tuttavia, abbiamo notato che questo passaggio manuale può portare a variabilità sperimentale nella resa e nell’integrità dei nuclei a seconda della quantità di forza esercitata durante l’omogeneizzazione, compromettendo la riproducibilità degli esperimenti. In questo caso, utilizzando una smerigliatrice automatica per tessuti con impostazioni fisse, sono stati ottenuti una buona qualità dei nuclei e una resa con maggiore coerenza in tutti gli esperimenti. Inoltre, l’automazione di questa fase riduce anche il tempo di esecuzione del protocollo (la fase di rottura del tessuto richiede circa 7 minuti), consentendo all’utente di prepararsi per le fasi successive. In secondo luogo, il protocollo descritto in questo studio è versatile, cioè è compatibile con diversi tessuti di specie diverse. Questo ci permette di evitare lunghe ottimizzazioni del protocollo, ad esempio per identificare tamponi/detergenti di omogeneizzazione per diversi tessuti 2,5,6. In terzo luogo, questo protocollo non dipende dall’accesso a un selezionatore a flusso per ottenere nuclei puliti, rendendolo così più accessibile per i laboratori che non dispongono delle attrezzature/competenze necessarie per lo smistamento a flusso. Invece, abbiamo ottimizzato la filtrazione basata sul gradiente di saccarosio per rimuovere la maggior parte dei detriti. Tuttavia, per il tessuto cerebrale in particolare, si raccomanda l’uso di un gradiente colloidale di silice invece di un gradiente di saccarosio per una rimozione più efficiente della mielina. Abbiamo anche scoperto che l’uso di un rotore a secchiello oscillante alla fine della fase di centrifugazione a gradiente colloidale saccarosio/silice riduce al minimo la perdita di nuclei. Pertanto, l’uso di un tale rotore è altamente raccomandato. In quarto luogo, dopo aver testato più metodi per contare i nuclei (conteggio manuale al microscopio, uso di diversi contatori automatici), si raccomanda l’uso di un contatore automatico di cellule fluorescenti22. L’uso di un colorante intercalante del DNA, come lo ioduro di propidio, aumenta l’accuratezza del conteggio dei nuclei. In quinto luogo, questo protocollo richiede circa 75 minuti dall’inizio al caricamento del chip microfluidico. Ciò contribuisce a garantire che l’integrità dei nuclei rimanga elevata durante l’elaborazione di più campioni. Infine, abbiamo riscontrato che il protocollo è compatibile anche con il tessuto incorporato nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT). Se si utilizza tale materiale, il tessuto può essere rimosso dal blocco OCT utilizzando un bisturi prima dell’omogeneizzazione.
Una sfida frequente nei set di dati di sequenziamento dell’RNA a singolo nucleo è la presenza di RNA ambientale, che può essere non nucleare (ad esempio, mitocondriale) e di derivazione nucleare27,28. Nel nostro protocollo, l’RNA mitocondriale (un proxy per l’RNA ambientale non nucleare) è basso anche prima del filtraggio (0,1-1,6% per i tessuti mostrati). Tuttavia, analogamente ad altri protocolli e set di dati, la contaminazione dell’RNA ambientale da geni altamente espressi nei nuclei di abbondanti tipi di cellule (come gli epatociti nel fegato, i neuroni nel cervello, ecc.) è ancora presente27. Esistono diversi strumenti bioinformatici, come CellBender, SoupX, ecc., in grado di rimuovere tale contaminazione dell’RNA ambientale prima dell’annotazione dei nuclei 29,30,31. Un’altra limitazione di questo protocollo è che, sebbene le fasi di disgregazione dei tessuti e di isolamento dei nuclei siano automatizzate, la produttività di questa fase è ancora limitante in quanto è possibile processare un solo campione alla volta. Tuttavia, poiché questa fase richiede solo circa 7 minuti per pezzo di tessuto, è comunque possibile elaborare più campioni in un lotto. In genere elaboriamo quattro campioni per lotto, ma abbiamo eseguito fino a sei campioni per lotto con buoni risultati. I recenti miglioramenti nel dissociatore robotico per consentire l’elaborazione parallela di due campioni contemporaneamente consentiranno l’elaborazione di 8-12 campioni per lotto, il che è compatibile con la produttività del chip microfluidico utilizzato per l’incapsulamento di singoli nuclei.
Sebbene non abbiamo utilizzato i nuclei isolati da questo protocollo per altre applicazioni a valle come ATAC-seq o snRNAseq utilizzando altre piattaforme, sulla base della qualità dei dati ottenuti con i reagenti di espressione genica qui utilizzati, riteniamo che il nostro protocollo dovrebbe essere compatibile con ulteriori applicazioni a valle. Tuttavia, il lavoro futuro comporterà il test di questo protocollo con altre applicazioni a valle, come ATAC-seq.
In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo di isolamento dei nuclei rapido, semplice e parzialmente automatizzato per il sequenziamento a valle dell’RNA di un singolo nucleo che si è dimostrato compatibile con diversi tipi di tessuti congelati di mammifero.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble e Matthias Selhausen per aver fornito i tessuti animali che sono stati analizzati in questo manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki e Martin Ebeling per il loro supporto bioinformatico.
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |