В исследовании описывается простой, быстрый и частично автоматизированный протокол выделения высококачественных ядер из замороженных тканей млекопитающих для последующего секвенирования одноядерной РНК.
Секвенирование одноклеточной и одноядерной РНК стало распространенным лабораторным применением из-за большого количества транскриптомного информации, которую они предоставляют. Секвенирование одноядерной РНК, в частности, полезно для изучения экспрессии генов в трудно диссоциированных тканях. Кроме того, этот подход совместим и с замороженными (архивными) материалами. В данной статье мы опишем протокол выделения высококачественных одиночных ядер из замороженных тканей млекопитающих для последующего секвенирования одноядерной РНК частично автоматизированным способом с использованием коммерчески доступных инструментов и реагентов. В частности, роботизированный диссоциатор используется для автоматизации и стандартизации гомогенизации тканей с последующим оптимизированным химическим градиентом для фильтрации ядер. Наконец, мы точно и автоматически подсчитываем ядра с помощью автоматического счетчика флуоресцентных клеток. Эффективность этого протокола демонстрируется на мозге мыши, почках крыс, а также на ткани печени и селезенки циномолгуса. Этот протокол прост, быстр и легко адаптируется к различным тканям млекопитающих, не требуя обширной оптимизации, и обеспечивает хорошее качество ядер для последующего секвенирования одноядерной РНК.
Секвенирование одноклеточной (sc) и одноядерной (sn) РНК стало широко используемым протоколом в молекулярной и клеточной биологии из-за более высокого разрешения экспрессии генов по сравнению с секвенированием объемной РНК. Тем не менее, выделение высококачественных одноклеточных и одноядерных препаратов из твердых тканей остается сложной задачей и часто является этапом, ограничивающим скорость в экспериментах sc/sn-RNAseq. Действительно, было разработано множество протоколов, в которых используются различные химические и механические процедуры для получения клеточных/ядерных суспензий 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Кроме того, стратегии очистки таких препаратов от мусора/комков и т. д. варьируются от сортировки по потоку до фильтрации и промывки. Такие протоколы часто являются ручными (что приводит к изменчивости, связанной с пользователем), могут занимать много времени (приводя к снижению жизнеспособности клетки/ядра) и/или могут требовать доступа к проточному цитометру для сортировки клеток/ядер. Это исследование было сосредоточено на разработке простого, быстрого и частично автоматизированного протокола выделения отдельных ядер из замороженных тканей млекопитающих для последующего секвенирования РНК. Мы сосредоточились именно на выделении ядер, а не на выделении клеток, поскольку оно совместимо с использованием замороженных тканей, что делает сбор/обработку образцов более практичным и позволяет беспристрастно группировать образцы, особенно в экспериментах с течением времени. Кроме того, несмотря на то, что ядерный транскриптом не полностью отражает клеточный транскриптом, несколько исследований показали, что данные секвенирования РНК одного ядра сопоставимы с данными секвенирования РНК одной клетки для идентификации типа клеток, хотя пропорции типов клеток могут варьироваться 6,16,17,18,19.
Выделение ядер состоит из нескольких этапов: 1) механическое или химическое разрушение ткани для высвобождения ядер, 2) очистка от мусора и комков и 3) точный подсчет ядер для подготовки к последующему применению. В ряде протоколов этап 1 часто включает в себя использование гомогенизатора Dounce для того, чтобы разрушить ткань 3,20. В качестве альтернативы можно использовать химические методы, хотя они часто должны быть оптимизированы для различных тканей 2,5,6. Мы убедились в том, что мануальная процедура разрушения тканей подвержена изменчивости, связанной с оператором, что приводит к изменению качества и выхода ядер. Для того, чтобы свести к минимуму техническую вариабельность и иметь более последовательный и воспроизводимый протокол, работающий в разных тканях, был разработан протокол, в котором используется коммерчески доступный роботизированный диссоциатор тканей21. На этапе 2, несмотря на то, что буферный обмен обычно является простейшим способом промывки ядер, мы использовали относительно короткую стадию центрифугирования градиента сахарозы для более тщательного удаления мусора. В частности, для мозговой ткани мы используем коллоидный градиент кремнезема вместо градиента сахарозы для более эффективного удаления миелина. Наконец, для подсчета использование гемоцитометра является золотым стандартом подсчета и визуального осмотра ядер. В нашем протоколе этот шаг может быть надежно автоматизирован с помощью коммерчески доступного автоматизированного счетчика флуоресцентных клеток22. Этот протокол был протестирован и совместим с несколькими замороженными тканями млекопитающих, включая мозг, почки, селезенку и печень, от различных видов млекопитающих (крыс, мышей и приматов) и обеспечивает ядра хорошего качества для последующего секвенирования одноядерной РНК с помощью коммерческой платформы на основе капель. Протокол занимает около 75 минут от подготовки ткани до начала процесса секвенирования одноядерной РНК.
Мы разработали универсальный и частично автоматизированный протокол получения высококачественных одиночных ядер из замороженных тканей млекопитающих и продемонстрировали протокол на мозге мыши, почках крыс, циномольгусной ткани печени и селезенки.
Сравнивая эффективность этого протокола с другими опубликованными протоколами секвенирования одноядерной РНК в тканях головного мозга, почек, селезенки и печени 6,7,20,24,25,26, мы видим, что мы можем обнаружить аналогичное количество генов и количество UMI в ядре и можем восстановить ожидаемые типы клеток. По сравнению с существующими методами, у этого протокола есть несколько преимуществ. Во-первых, протокол в этом исследовании автоматизирует гомогенизацию тканей и выделение отдельных ядер. Это достигается с помощью роботизированного разрушителя тканей21. В большинстве протоколов ткань гомогенизируется с помощью гомогенизатора Dounce с целью высвобождения одиночных ядер 3,20. Однако мы заметили, что этот ручной шаг может привести к экспериментальной изменчивости выхода ядер и целостности в зависимости от величины силы, приложенной во время гомогенизации, что ставит под угрозу воспроизводимость экспериментов. Здесь, с помощью автоматизированного измельчителя тканей с фиксированными настройками, было получено хорошее качество ядер и выход с большей стабильностью в ходе экспериментов. Кроме того, автоматизация этого этапа также сокращает время, затрачиваемое на выполнение протокола (этап разрушения тканей занимает около 7 минут), что позволяет пользователю подготовиться к последующим шагам. Во-вторых, протокол, описанный в этом исследовании, универсален, т.е. совместим с разными тканями разных видов. Это позволяет избежать длительной оптимизации протокола, например, для определения гомогенизационных буферов/детергентов для различных тканей 2,5,6. В-третьих, этот протокол не зависит от доступа к поточному сортировщику для получения чистых ядер, что делает его более доступным для лабораторий, которые не имеют необходимого оборудования/опыта для поточной сортировки. Вместо этого мы оптимизировали фильтрацию на основе градиента сахарозы, чтобы удалить большую часть мусора. Однако, в частности, для мозговой ткани рекомендуется использовать коллоидный градиент кремния вместо градиента сахарозы для более эффективного удаления миелина. Мы также обнаружили, что использование ротора с качающимся ковшом в конце стадии коллоидного градиентного центрифугирования сахарозы/кремнезема сводит к минимуму потерю ядер. Следовательно, использование такого ротора настоятельно рекомендуется. В-четвертых, после тестирования нескольких методов подсчета ядер (ручной подсчет под микроскопом, использование нескольких автоматических счетчиков) рекомендуется использовать автоматизированный флуоресцентный счетчик клеток22. Использование интеркалирующего красителя ДНК, такого как йодид пропидия, повышает точность подсчета ядер. В-пятых, этот протокол занимает около 75 минут от запуска до загрузки микрофлюидного чипа. Это помогает гарантировать, что целостность ядер остается высокой при обработке нескольких образцов. Наконец, мы обнаружили, что протокол также совместим с тканями, внедренными в компаунд с оптимальной температурой резания (OCT). При использовании такого материала ткань может быть удалена из ОКТ-блока с помощью скальпеля перед гомогенизацией.
Одной из частых проблем в наборах данных секвенирования одноядерных РНК является наличие эмбиентной РНК, которая может быть как неядерной (например, митохондриальной), так и ядерной. В нашем протоколе уровень митохондриальной РНК (аналог неядерной окружающей РНК) низок даже до фильтрации (0,1-1,6% для показанных тканей). Однако, как и в случае с другими протоколами и наборами данных, загрязнение окружающей среды РНК высокоэкспрессируемыми генами в ядрах распространенных типов клеток (таких как гепатоциты в печени, нейроны в мозге и т. д.) всееще присутствует. Существует несколько биоинформатических инструментов, таких как CellBender, SoupX и т.д., которые могут удалить такое загрязнение окружающей РНК до аннотации ядер 29,30,31. Еще одно ограничение этого протокола заключается в том, что, несмотря на то, что этапы разрушения тканей и выделения ядер автоматизированы, пропускная способность этого этапа по-прежнему ограничена, поскольку одновременно может быть обработан только один образец. Однако, поскольку этот этап занимает всего около 7 минут на каждый кусочек ткани, несколько образцов все еще могут быть обработаны в партии. Обычно мы обрабатываем четыре образца за партию, но с хорошими результатами мы получаем до шести образцов за партию. Недавние усовершенствования в роботизированном диссоциаторе, позволяющие параллельно обрабатывать два образца одновременно, позволят обрабатывать 8-12 образцов за партию, что совместимо с пропускной способностью микрофлюидного чипа, используемого для инкапсуляции отдельных ядер.
Несмотря на то, что мы не использовали ядра, выделенные по этому протоколу, для других нисходящих приложений, таких как ATAC-seq или snRNAseq с использованием других платформ, основываясь на качестве данных, полученных с помощью используемых здесь реагентов экспрессии генов, мы считаем, что наш протокол должен быть совместим с другими нисходящими приложениями. Однако будущая работа будет включать в себя тестирование этого протокола с другими последующими приложениями, такими как ATAC-seq.
В заключение, мы разработали быстрый, простой и частично автоматизированный протокол выделения ядер для последующего секвенирования одноядерной РНК, который, как было продемонстрировано, совместим с различными типами замороженных тканей млекопитающих.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Филипа Бохнера, Марион Ричардсон, Петру Штойбле и Маттиаса Зельхаузена за предоставленные ткани животных, которые были проанализированы в этой рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить Петру Швали, Класа Хатье, Роланда Шмуки и Мартина Эбелинга за их поддержку в области биоинформатики.
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |