L’étude décrit un protocole simple, rapide et partiellement automatisé pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN de noyaux uniques en aval.
Le séquençage de l’ARN unicellulaire et mononoyau est devenu une application courante en laboratoire en raison de la richesse de l’information transcriptomique qu’il fournit. Le séquençage de l’ARN à noyau unique, en particulier, est utile pour étudier l’expression des gènes dans les tissus difficiles à dissocier. De plus, cette approche est également compatible avec les documents congelés (archives). Nous décrivons ici un protocole permettant d’isoler des noyaux uniques de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés pour le séquençage de l’ARN d’un seul noyau en aval de manière partiellement automatisée à l’aide d’instruments et de réactifs disponibles dans le commerce. Plus précisément, un dissociateur robotisé est utilisé pour automatiser et standardiser l’homogénéisation des tissus, suivie d’un gradient chimique optimisé pour filtrer les noyaux. Enfin, nous comptons les noyaux avec précision et automatiquement à l’aide d’un compteur automatisé de cellules fluorescentes. La performance de ce protocole est démontrée sur le cerveau de souris, les reins de rat et les tissus du foie et de la rate cynomolgus. Ce protocole est simple, rapide et facilement adaptable à divers tissus de mammifères sans nécessiter d’optimisation poussée et fournit des noyaux de bonne qualité pour le séquençage de l’ARN à noyau unique en aval.
Le séquençage de l’ARN unicellulaire (sc) et mononoyau (sn) est devenu un protocole couramment utilisé en biologie moléculaire et cellulaire en raison de la résolution accrue de l’expression génique par rapport au séquençage de l’ARN en vrac. Cependant, l’isolement de préparations de cellules uniques et de noyaux uniques de bonne qualité à partir de tissus solides reste un défi et constitue souvent l’étape limitant la vitesse dans les expériences sc/sn-RNAseq. En effet, une pléthore de protocoles ont été développés qui utilisent diverses procédures chimiques et mécaniques pour obtenir des suspensions cellules/noyaux 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . De plus, les stratégies de nettoyage de ces préparations des débris, des amas, etc., vont du tri par flux à la filtration en passant par le lavage. De tels protocoles sont souvent manuels (ce qui entraîne une variabilité liée à l’utilisateur), peuvent prendre beaucoup de temps (ce qui réduit la viabilité des cellules/noyaux) et/ou peuvent nécessiter l’accès à un cytomètre en flux pour le tri cellule/noyau. Cette étude s’est concentrée sur le développement d’un protocole simple, rapide et partiellement automatisé d’isolement de noyaux uniques à partir de tissus de mammifères congelés pour des applications de séquençage de l’ARN en aval. Nous nous sommes concentrés spécifiquement sur l’isolement des noyaux par opposition à l’isolement cellulaire, car il est compatible avec l’utilisation de tissus congelés, ce qui rend la collecte et le traitement des échantillons plus pratiques et permet un dosage non biaisé des échantillons, en particulier dans les expériences temporelles. De plus, bien que le transcriptome nucléaire ne reflète pas entièrement le transcriptome cellulaire, plusieurs études ont maintenant montré que les données de séquençage de l’ARN à noyau unique sont comparables aux données de séquençage de l’ARN d’une seule cellule pour l’identification du type cellulaire, même si les proportions de types cellulaires peuvent varier 6,16,17,18,19.
L’isolement des noyaux se compose de plusieurs étapes : 1) la perturbation mécanique ou chimique des tissus pour libérer les noyaux, 2) le nettoyage des débris et des amas, et 3) le comptage précis des noyaux pour la préparation des applications en aval. Dans un certain nombre de protocoles, l’étape 1 implique fréquemment l’utilisation d’un homogénéisateur Dounce afin de perturber le tissu 3,20. Alternativement, des méthodes chimiques peuvent être utilisées, bien que celles-ci doivent souvent être optimisées pour différents tissus 2,5,6. Nous avons constaté qu’une procédure manuelle de perturbation tissulaire est sujette à une variabilité associée à l’opérateur, ce qui entraîne une qualité et un rendement variables des noyaux. Afin de minimiser la variabilité technique et de disposer d’un protocole plus cohérent et reproductible qui fonctionne sur tous les tissus, un protocole qui utilise un dissociateur tissulaire robotisé disponible dans le commerce a été développé21. Pour l’étape 2, bien que l’échange de tampon soit généralement le moyen le plus simple de laver les noyaux, nous avons adopté l’utilisation d’une étape de centrifugation à gradient de saccharose relativement courte pour avoir une élimination plus complète des débris. Pour le tissu cérébral en particulier, nous utilisons un gradient colloïdal de silice au lieu d’un gradient de saccharose pour une élimination plus efficace de la myéline. Enfin, pour le comptage, l’utilisation d’un hémocytomètre est l’étalon-or pour le comptage et l’inspection visuelle des noyaux. Dans notre protocole, cette étape peut être automatisée de manière fiable à l’aide d’un compteur de cellules fluorescentes automatisé disponible dans le commerce22. Ce protocole a été testé et est compatible avec plusieurs tissus de mammifères congelés, y compris le cerveau, les reins, la rate et le foie, de différentes espèces de mammifères (rat, souris et primate non humain) et fournit des noyaux de bonne qualité pour le séquençage de l’ARN à noyau unique en aval avec une plate-forme commerciale à base de gouttelettes. Le protocole prend environ 75 minutes entre la préparation des tissus et le début du processus de séquençage de l’ARN à noyau unique.
Nous avons développé un protocole polyvalent et partiellement automatisé pour obtenir des noyaux uniques de haute qualité à partir de tissus de mammifères congelés et démontré le protocole sur le cerveau de souris, les reins de rat et les tissus de foie et de rate cynomolgus.
En comparant les performances de ce protocole à celles d’autres protocoles publiés pour le séquençage de l’ARN à noyau unique dans le cerveau, les reins, la rate et les tissus hépatiques 6,7,20,24,25,26, nous observons que nous sommes capables de détecter un nombre similaire de gènes et de nombres UMI par noyau et que nous sommes capables de récupérer les types de cellules attendus. Par rapport aux méthodes existantes, ce protocole présente plusieurs avantages. Tout d’abord, le protocole de cette étude automatise l’homogénéisation tissulaire et l’isolement de noyaux uniques. Ceci est réalisé grâce à l’utilisation d’un perturbateur tissulaire robotisé21. Dans la plupart des protocoles, le tissu est homogénéisé à l’aide d’un homogénéisateur Dounce afin de libérer des noyaux uniques 3,20. Cependant, nous avons remarqué que cette étape manuelle peut conduire à une variabilité expérimentale du rendement et de l’intégrité des noyaux en fonction de la quantité de force exercée lors de l’homogénéisation, compromettant la reproductibilité des expériences. Ici, en utilisant un broyeur de tissus automatisé avec des réglages fixes, une bonne qualité de noyaux et un rendement plus constant ont été obtenus à travers les expériences. De plus, l’automatisation de cette étape réduit également le temps de prise en main du protocole (l’étape de perturbation tissulaire prend environ 7 minutes), ce qui permet à l’utilisateur de se préparer aux étapes suivantes. Deuxièmement, le protocole décrit dans cette étude est polyvalent, c’est-à-dire qu’il est compatible avec différents tissus de différentes espèces. Cela nous permet d’éviter une longue optimisation du protocole, par exemple pour identifier des tampons/détergents d’homogénéisation pour différents tissus 2,5,6. Troisièmement, ce protocole ne dépend pas de l’accès à un trieur de flux pour obtenir des noyaux propres, ce qui le rend plus accessible aux laboratoires qui ne disposent pas de l’équipement/de l’expertise requis pour le tri de flux. Au lieu de cela, nous avons optimisé la filtration basée sur le gradient de saccharose pour éliminer la plupart des débris. Cependant, pour le tissu cérébral en particulier, l’utilisation d’un gradient colloïdal de silice au lieu d’un gradient de saccharose est recommandée pour une élimination plus efficace de la myéline. Nous avons également constaté que l’utilisation d’un rotor à godets oscillants à la fin de l’étape de centrifugation à gradient colloïdal saccharose/silice minimise la perte de noyaux. Par conséquent, l’utilisation d’un tel rotor est fortement recommandée. Quatrièmement, après avoir testé plusieurs méthodes de comptage des noyaux (comptage manuel au microscope, utilisation de plusieurs compteurs automatisés), l’utilisation d’un compteur automatisé de cellules fluorescentes22 est recommandée. L’utilisation d’un colorant intercalant l’ADN, tel que l’iodure de propidium, augmente la précision du comptage des noyaux. Cinquièmement, ce protocole prend environ 75 minutes entre le début et le chargement de la puce microfluidique. Cela permet de s’assurer que l’intégrité des noyaux reste élevée lors du traitement de plusieurs échantillons. Enfin, nous avons constaté que le protocole était également compatible avec les tissus incorporés dans un composé à température de coupe optimale (OCT). En cas d’utilisation d’un tel matériau, le tissu peut être retiré du bloc OCT à l’aide d’un scalpel avant l’homogénéisation.
L’un des défis fréquents dans les ensembles de données de séquençage de l’ARN à noyau unique est la présence d’ARN ambiant, qui peut être non nucléaire (par exemple, mitochondrial) ainsi que d’origine nucléaire27,28. Dans notre protocole, l’ARN mitochondrial (un indicateur de l’ARN ambiant non nucléaire) est faible même avant le filtrage (0,1-1,6% pour les tissus présentés). Cependant, à l’instar d’autres protocoles et ensembles de données, la contamination par l’ARN ambiant à partir de gènes hautement exprimés dans les noyaux de types cellulaires abondants (tels que les hépatocytes dans le foie, les neurones dans le cerveau, etc.) est toujours présente27. Il existe plusieurs outils bioinformatiques, tels que CellBender, SoupX, etc., qui permettent d’éliminer une telle contamination par l’ARN ambiant avant l’annotation des noyaux 29,30,31. Une autre limite de ce protocole est que, bien que les étapes de perturbation tissulaire et d’isolement des noyaux soient automatisées, le débit de cette étape est toujours limité car un seul échantillon peut être traité à la fois. Cependant, comme cette étape ne prend qu’environ 7 minutes par morceau de tissu, plusieurs échantillons peuvent toujours être traités dans un lot. Nous traitons généralement quatre échantillons par lot, mais nous avons fait jusqu’à six échantillons par lot avec de bons résultats. Les récentes améliorations apportées au dissociateur robotisé pour permettre le traitement parallèle de deux échantillons simultanément permettront le traitement de 8 à 12 échantillons par lot, ce qui est compatible avec le débit de la puce microfluidique utilisée pour l’encapsulation de noyaux uniques.
Bien que nous n’ayons pas utilisé les noyaux isolés par ce protocole pour d’autres applications en aval telles que l’ATAC-seq ou le snRNAseq en utilisant d’autres plateformes, sur la base de la qualité des données obtenues avec les réactifs d’expression génique utilisés ici, nous pensons que notre protocole devrait être compatible avec d’autres applications en aval. Cependant, les travaux futurs consisteront à tester ce protocole avec d’autres applications en aval, telles que ATAC-seq.
En conclusion, nous avons développé un protocole d’isolement de noyaux rapide, simple et partiellement automatisé pour le séquençage de l’ARN d’un seul noyau en aval qui s’est avéré compatible avec différents types de tissus de mammifères congelés.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble et Matthias Selhausen pour avoir fourni les tissus animaux qui ont été analysés dans ce manuscrit. Nous tenons également à remercier Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki et Martin Ebeling pour leur soutien bioinformatique.
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |