该研究描述了一种简单、快速和部分自动化的方案,用于从冷冻哺乳动物组织中分离高质量细胞核,用于下游单核RNA测序。
单细胞和单核RNA测序由于提供了丰富的转录组学信息,已成为常见的实验室应用。特别是单核RNA测序,可用于研究难以解离组织中的基因表达。此外,这种方法还与冷冻(存档)材料兼容。在这里,我们描述了一种从冷冻哺乳动物组织中分离高质量单核的方案,用于使用市售仪器和试剂以部分自动化方式进行下游单核RNA测序。具体来说,机器人解离器用于自动化和标准化组织均质化,然后优化化学梯度过滤细胞核。最后,我们使用自动荧光细胞计数仪准确、自动地对细胞核进行计数。该方案的性能在小鼠脑,大鼠肾脏和食蟹猴肝脏和脾脏组织上得到证明。该方案简单、快速且易于适应各种哺乳动物组织,无需大量优化,并为下游单核 RNA 测序提供高质量的细胞核。
单细胞 (sc) 和单核 (sn) RNA 测序已成为分子和细胞生物学中常用的方案,因为与批量 RNA 测序相比,基因表达的分辨率更高。然而,从实体组织中分离高质量的单细胞和单核制剂仍然是一个挑战,并且通常是sc/sn-RNAseq实验中的限速步骤。事实上,已经开发了大量的方案,使用各种化学和机械程序来获得细胞/细胞核悬浮液 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 .此外,从碎屑/团块等中清除此类制剂的策略包括流动分选、过滤和洗涤。此类方案通常是手动的(导致与用户相关的变异性),可能很耗时(导致细胞/细胞核活力降低),和/或可能需要使用流式细胞仪进行细胞/细胞核分选。本研究的重点是开发一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核方案,用于下游 RNA 测序应用。我们特别关注细胞核分离,而不是细胞分离,因为它与冷冻组织的使用兼容,使样品收集/处理更加实用,并实现样品的无偏批次,特别是在时间过程实验中。此外,尽管核转录组不能完全反映细胞转录组,但现在已经有几项研究表明,单细胞核RNA测序数据与单细胞RNA测序数据相当,用于细胞类型鉴定,即使细胞类型的比例可以变化6,16,17,18,19。
细胞核分离包括几个步骤:1)对组织进行机械或化学破坏以释放细胞核,2)清理碎片和团块,以及3)准确计数细胞核,为下游应用做准备。在许多方案中,步骤1通常涉及使用Dounce匀浆器以破坏组织3,20。或者,可以使用化学方法,尽管这些方法通常需要针对不同的组织进行优化2,5,6。我们经验到,手动组织破坏程序容易出现与操作者相关的变异性,导致细胞核的质量和产量参差不齐。为了最大限度地减少技术变异性并具有跨组织工作的更一致和可重复的方案,开发了一种使用市售机器人组织解离器的方案21。对于第 2 步,虽然缓冲液置换通常是洗涤细胞核的最简单方法,但我们采用了相对较短的蔗糖梯度离心步骤,以更彻底地去除碎屑。具体到脑组织,我们使用二氧化硅胶体梯度代替蔗糖梯度,以更有效地去除髓鞘。最后,对于计数,使用血细胞计数器是计数和目视检查细胞核的金标准。在我们的实验方案中,可以使用市售的自动荧光细胞计数器22可靠地自动化该步骤。该方案已经过测试,与来自不同哺乳动物物种(大鼠、小鼠和非人灵长类动物)的几种冷冻哺乳动物组织(包括脑、肾脏、脾脏和肝脏)兼容,并通过基于液滴的商业平台为下游单核 RNA 测序提供高质量的细胞核。从组织制备到单核RNA测序工作流程的开始,该方案大约需要75分钟。
我们开发了一种多功能且部分自动化的方案,用于从冷冻哺乳动物组织获得高质量的单核,并在小鼠脑、大鼠肾脏和食蟹猴肝脏和脾脏组织中展示了该方案。
当将该协议的性能与其他已发表的在脑,肾脏,脾脏和肝组织中进行单核RNA测序的方案进行比较时,我们观察到我们能够检测到相似数量的基因和每个细胞核的UMI计数,并且能够恢复预期的细胞类型。与现有方法相比,该协议有几个优点。首先,本研究中的方案可自动进行组织匀浆和单核分离。这是通过使用机器人组织破坏器21实现的。在大多数方案中,用 Dounce 匀浆器匀浆组织以释放单核 3,20。然而,我们注意到,这个手动步骤会导致原子核产量和完整性的实验变化,这取决于均质化过程中施加的力的大小,从而影响实验的可重复性。在这里,通过使用具有固定设置的自动组织研磨机,在实验中获得了良好的细胞核质量和产量以及更高的一致性。此外,自动化此步骤还减少了方案的手动操作时间(组织破碎步骤大约需要 7 分钟),使用户能够为后续步骤做好准备。其次,本研究中描述的方案是通用的,即它与来自不同物种的不同组织兼容。这使我们能够避免冗长的方案优化,例如,识别不同组织的均质缓冲液/去污剂2,5,6。第三,该协议不依赖于访问流动分选机以获得干净的细胞核,因此对于没有流动分选所需设备/专业知识的实验室来说,该协议更容易获得。相反,我们优化了基于蔗糖梯度的过滤,以去除大部分碎屑。然而,特别是对于脑组织,建议使用二氧化硅胶体梯度而不是蔗糖梯度,以更有效地去除髓鞘。我们还发现,在蔗糖/二氧化硅胶体梯度离心步骤结束时使用水平转子可以最大限度地减少细胞核损失。因此,强烈建议使用这种转子。第四,在测试了多种细胞核计数方法(在显微镜下手动计数,使用多个自动计数器)后,建议使用自动荧光细胞计数器22。使用 DNA 嵌入染料(如碘化丙啶)可提高细胞核计数的准确性。第五,该协议从开始到加载微流控芯片大约需要75分钟。这有助于确保在处理多个样品时细胞核完整性保持高水平。最后,我们发现该协议也与最佳切割温度化合物(OCT)包埋的组织兼容。如果使用这种材料,可以在均质化之前使用手术刀将组织从 OCT 块中取出。
单核 RNA 测序数据集中一个常见的挑战是环境 RNA 的存在,它可以是非核的(例如线粒体),也可以是核衍生的27,28。在我们的实验方案中,线粒体RNA(非核环境RNA的代理)即使在过滤之前也很低(所示组织的0.1-1.6%)。然而,与其他方案和数据集类似,来自丰富细胞类型(如肝脏中的肝细胞、大脑中的神经元等)细胞核中高表达基因的环境RNA污染仍然存在27。存在几种生物信息学工具,如 CellBender、SoupX 等,可以在细胞核注释之前去除这种环境 RNA 污染 29,30,31。该协议的另一个局限性是,尽管组织破碎和细胞核分离步骤是自动化的,但该步骤的通量仍然受到限制,因为一次只能处理一个样品。然而,由于此步骤每块组织仅需要大约 7 分钟,因此仍然可以批量处理多个样品。我们通常每批处理四个样品,但每批最多处理六个样品,效果很好。机器人解离器最近进行了改进,允许同时并行处理两个样品,这将使每批处理 8-12 个样品成为可能,这与用于单核封装的微流控芯片的通量兼容。
虽然我们尚未将该协议分离的细胞核用于其他下游应用,例如使用其他平台的ATAC-seq或snRNAseq,但基于此处使用的基因表达试剂获得的数据质量,我们认为我们的方案应该与其他下游应用兼容。然而,未来的工作将涉及使用其他下游应用程序(如ATAC-seq)测试该协议。
总之,我们开发了一种快速、简单且部分自动化的细胞核分离方案,用于下游单核RNA测序,该方案已被证明与不同类型的冷冻哺乳动物组织兼容。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢 Filip Bochner、Marion Richardson、Petra Staeuble 和 Matthias Selhausen 提供本手稿中分析的动物组织。我们还要感谢Petra Schwalie、Klas Hatje、Roland Schmucki和Martin Ebeling对生物信息学的支持。
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |