تصف الدراسة بروتوكولا بسيطا وسريعا ومؤتمتا جزئيا لعزل النوى عالية الجودة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في اتجاه مجرى النهر.
أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة تطبيقات معملية شائعة بسبب ثروة المعلومات النسخية التي توفرها. يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ، على وجه الخصوص ، مفيدا في التحقيق في التعبير الجيني في الأنسجة التي يصعب فصلها. علاوة على ذلك ، يتوافق هذا النهج أيضا مع المواد المجمدة (المحفوظة). هنا ، نصف بروتوكولا لعزل النوى المفردة عالية الجودة من أنسجة الثدييات المجمدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في اتجاه مجرى النهر بطريقة مؤتمتة جزئيا باستخدام الأدوات والكواشف المتاحة تجاريا. على وجه التحديد ، يتم استخدام جهاز فصل آلي لأتمتة وتوحيد تجانس الأنسجة ، متبوعا بتدرج كيميائي محسن لتصفية النوى. وأخيرا، نحسب النوى بدقة وتلقائية باستخدام عداد الخلايا الفلورية الآلي. يتم إثبات أداء هذا البروتوكول على دماغ الفأر وكلية الفئران وكبد cynomolgus وأنسجة الطحال. هذا البروتوكول مباشر وسريع وقابل للتكيف بسهولة مع أنسجة الثدييات المختلفة دون الحاجة إلى تحسين واسع النطاق ويوفر نوى ذات نوعية جيدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في المصب.
أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (sc) والنواة الواحدة (sn) بروتوكولات شائعة الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية والخلوية بسبب زيادة دقة التعبير الجيني مقارنة بتسلسل الحمض النووي الريبي السائب. ومع ذلك ، فإن عزل مستحضرات الخلية المفردة والنوى المفردة ذات النوعية الجيدة من الأنسجة الصلبة لا يزال يمثل تحديا وغالبا ما يكون خطوة تحديد المعدل في تجارب sc / sn-RNAseq. في الواقع ، تم تطوير عدد كبير من البروتوكولات التي تستخدم إجراءات كيميائية وميكانيكية مختلفة للحصول على معلقات الخلية / النوى1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15. علاوة على ذلك ، تتراوح استراتيجيات تنظيف هذه المستحضرات من الحطام / الكتل ، وما إلى ذلك ، من فرز التدفق إلى الترشيح إلى الغسيل. غالبا ما تكون هذه البروتوكولات يدوية (مما يؤدي إلى التباين المرتبط بالمستخدم) ، ويمكن أن تستغرق وقتا طويلا (مما يؤدي إلى تقليل صلاحية الخلية / النواة) ، و / أو قد تتطلب الوصول إلى مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلية / النواة. ركزت هذه الدراسة على تطوير بروتوكول عزل أحادي النوى بسيط وسريع ومؤتمت جزئيا من أنسجة الثدييات المجمدة لتطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبي النهائية. ركزنا بشكل خاص على عزل النوى بدلا من عزل الخلايا لأنه متوافق مع استخدام الأنسجة المجمدة ، مما يجعل جمع / معالجة العينات أكثر عملية وتمكين التجميع غير المتحيز للعينات ، خاصة في تجارب الدورة الزمنية. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن النسخ النووي لا يعكس تماما النسخ الخلوي ، فقد أظهرت العديد من الدراسات الآن أن بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى قابلة للمقارنة مع بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد نوع الخلية ، على الرغم من أن نسب أنواع الخلايا يمكن أن تختلف6،16،17،18،19.
يتكون عزل النوى من عدة خطوات: 1) التعطيل الميكانيكي أو الكيميائي للأنسجة لإطلاق النوى ، 2) تنظيف الحطام والكتل ، و 3) العد الدقيق للنوى للتحضير للتطبيقات النهائية. في عدد من البروتوكولات ، تتضمن الخطوة 1 بشكل متكرر استخدام خالط Dounce من أجل تعطيل الأنسجة 3,20. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الطرق الكيميائية ، على الرغم من أنها غالبا ما تحتاج إلى تحسين الأنسجةالمختلفة 2،5،6. لقد اختبرنا أن إجراء تعطيل الأنسجة اليدوي عرضة للتغيرات المرتبطة بالمشغل ، مما يؤدي إلى جودة متغيرة وإنتاجية النوى. من أجل تقليل التباين التقني والحصول على بروتوكول أكثر اتساقا وقابلية للتكرار يعمل عبر الأنسجة ، تم تطوير بروتوكول يستخدم جهاز فصل الأنسجة الروبوتية المتاح تجاريا21. بالنسبة للخطوة 2 ، على الرغم من أن التبادل المؤقت عادة ما يكون أبسط وسيلة لغسل النوى ، فقد اعتمدنا استخدام خطوة طرد مركزي متدرجة قصيرة نسبيا للسكروز لإزالة أكثر شمولا للحطام. بالنسبة لأنسجة المخ على وجه التحديد، نستخدم تدرج غرواني السيليكا بدلا من تدرج السكروز لإزالة الميالين بشكل أكثر فعالية. أخيرا ، بالنسبة للعد ، فإن استخدام مقياس الدم هو المعيار الذهبي لحساب النوى وفحصها بصريا. في بروتوكولنا ، يمكن أتمتة هذه الخطوة بشكل موثوق باستخدام عداد خلايا الفلورسنت الآليالمتاح تجاريا 22. تم اختبار هذا البروتوكول وهو متوافق مع العديد من أنسجة الثدييات المجمدة ، بما في ذلك الدماغ والكلى والطحال والكبد ، من أنواع مختلفة من الثدييات (الفئران والفأر والرئيسيات غير البشرية) ويوفر نوى ذات نوعية جيدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة مع منصة تجارية قائمة على القطيرات. يستغرق البروتوكول حوالي 75 دقيقة من تحضير الأنسجة إلى بدء سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.
لقد طورنا بروتوكولا متعدد الاستخدامات ومؤتمتا جزئيا للحصول على نوى مفردة عالية الجودة من أنسجة الثدييات المجمدة وأظهرنا البروتوكول على دماغ الفأر وكلية الفئران وكبد cynomolgus وأنسجة الطحال.
عند مقارنة أداء هذا البروتوكول بأداء البروتوكولات المنشورة الأخرى لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في أنسجة الدماغ والكلى والطحال والكبد6،7،20،24،25،26 ، نلاحظ أننا قادرون على اكتشاف عدد مماثل من الجينات وعدد UMI لكل نواة وقادرون على استعادة أنواع الخلايا المتوقعة. بالمقارنة مع الطرق الحالية ، هناك العديد من المزايا لهذا البروتوكول. أولا ، يعمل البروتوكول في هذه الدراسة على أتمتة تجانس الأنسجة وعزل النوى المفردة. يتم تحقيق ذلك باستخدام اضطراب الأنسجة الروبوتية21. في معظم البروتوكولات ، يتم تجانس الأنسجة باستخدام خالط Dounce من أجل تحرير نواة واحدة 3,20. ومع ذلك ، فقد لاحظنا أن هذه الخطوة اليدوية يمكن أن تؤدي إلى تباين تجريبي في إنتاجية النوى وسلامتها اعتمادا على مقدار القوة التي تمارس أثناء التجانس ، مما يضر بقابلية استنساخ التجارب. هنا ، باستخدام مطحنة الأنسجة الآلية ذات الإعدادات الثابتة ، تم الحصول على جودة نوى جيدة وعائد مع تناسق أكبر عبر التجارب. علاوة على ذلك ، فإن أتمتة هذه الخطوة تقلل أيضا من الوقت العملي للبروتوكول (تستغرق خطوة تعطيل الأنسجة حوالي 7 دقائق) ، مما يسمح للمستخدم بالاستعداد للخطوات اللاحقة. ثانيا ، البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة متعدد الاستخدامات ، أي أنه متوافق مع الأنسجة المختلفة من الأنواع المختلفة. يتيح لنا ذلك تجنب تحسين البروتوكول المطول ، على سبيل المثال ، لتحديد مخازن / منظفات التجانس للأنسجةالمختلفة 2،5،6. ثالثا ، لا يعتمد هذا البروتوكول على الوصول إلى فارز التدفق من أجل الحصول على نوى نظيفة ، مما يجعله في متناول المختبرات التي لا تملك المعدات / الخبرة المطلوبة لفرز التدفق. بدلا من ذلك ، قمنا بتحسين الترشيح القائم على تدرج السكروز لإزالة معظم الحطام. ومع ذلك ، بالنسبة لأنسجة المخ على وجه الخصوص ، يوصى باستخدام تدرج غرواني السيليكا بدلا من تدرج السكروز لإزالة الميالين بشكل أكثر كفاءة. لقد وجدنا أيضا أن استخدام دوار دلو متأرجح في نهاية خطوة الطرد المركزي المتدرجة للسكروز / السيليكا يقلل من فقد النوى. وبالتالي ، يوصى بشدة باستخدام مثل هذا الدوار. رابعا ، بعد اختبار طرق متعددة لحساب النوى (العد اليدوي تحت المجهر ، واستخدام العديد من العدادات الآلية) ، يوصى باستخدام عداد خلية الفلورسنتالآلي 22. يزيد استخدام صبغة إقحام الحمض النووي ، مثل يوديد البروبيديوم ، من دقة عد النواة. خامسا ، يستغرق هذا البروتوكول حوالي 75 دقيقة من البداية إلى تحميل شريحة الموائع الدقيقة. يساعد هذا في ضمان بقاء سلامة النوى عالية عند معالجة عينات متعددة. أخيرا ، وجدنا أن البروتوكول متوافق أيضا مع الأنسجة المضمنة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). في حالة استخدام مثل هذه المواد ، يمكن إزالة الأنسجة من كتلة OCT باستخدام مشرط قبل التجانس.
أحد التحديات المتكررة في مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى هو وجود الحمض النووي الريبي المحيط ، والذي يمكن أن يكون غير نووي (على سبيل المثال ، الميتوكوندريا) وكذلك مشتق من الطاقةالنووية 27,28. في بروتوكولنا ، يكون الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا (وكيل للحمض النووي الريبي المحيط غير النووي) منخفضا حتى قبل التصفية (0.1-1.6٪ للأنسجة الموضحة). ومع ذلك ، على غرار البروتوكولات ومجموعات البيانات الأخرى ، لا يزال تلوث الحمض النووي الريبي المحيط من الجينات عالية التعبير في نوى أنواع الخلايا الوفيرة (مثل خلايا الكبد في الكبد ، والخلايا العصبية في الأدمغة ، وما إلى ذلك) موجودا27. توجد العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية ، مثل CellBender و SoupX وما إلى ذلك ، والتي يمكنها إزالة تلوث الحمض النووي الريبي المحيط قبل التعليق التوضيحيللنوى 29،30،31. هناك قيد آخر لهذا البروتوكول وهو أنه على الرغم من أن خطوات تعطيل الأنسجة وعزل النوى مؤتمتة ، إلا أن إنتاجية هذه الخطوة لا تزال محدودة حيث يمكن معالجة عينة واحدة فقط في كل مرة. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه الخطوة تستغرق حوالي 7 دقائق فقط لكل قطعة من الأنسجة ، فلا يزال من الممكن معالجة عينات متعددة دفعة واحدة. نقوم عادة بمعالجة أربع عينات لكل دفعة ولكننا قمنا بعمل ما يصل إلى ست عينات لكل دفعة بنتائج جيدة. ستمكن التحسينات الأخيرة في جهاز الانفصال الآلي للسماح بالمعالجة المتوازية لعينتين في وقت واحد من معالجة 8-12 عينة لكل دفعة ، وهو ما يتوافق مع إنتاجية رقاقة الموائع الدقيقة المستخدمة في تغليف النوى المفردة.
على الرغم من أننا لم نستخدم النوى المعزولة بواسطة هذا البروتوكول لتطبيقات المصب الأخرى مثل ATAC-seq أو snRNAseq باستخدام منصات أخرى ، بناء على جودة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام كواشف التعبير الجيني المستخدمة هنا ، نعتقد أن بروتوكولنا يجب أن يكون متوافقا مع تطبيقات المصب الإضافية. ومع ذلك ، سيشمل العمل المستقبلي اختبار هذا البروتوكول مع تطبيقات المصب الأخرى ، مثل ATAC-seq.
في الختام ، قمنا بتطوير بروتوكول عزل نوى سريع وبسيط ومؤتمت جزئيا لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في اتجاه مجرى النهر والذي ثبت أنه متوافق مع أنواع مختلفة من أنسجة الثدييات المجمدة.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا فيليب بوشنر وماريون ريتشاردسون وبيترا ستويبل وماتياس سيلهاوزن على توفير الأنسجة الحيوانية التي تم تحليلها في هذه المخطوطة. نود أيضا أن نشكر بيترا شوالي وكلاس هاتجي ورولاند شموكي ومارتن إبلينغ على دعمهم للمعلوماتية الحيوية.
1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
Dry ice | – | – | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
Heatblock | |||
High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Mini Centrifuge | – | – | |
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
Singulator 100 System | S2 Genomics | – | Commercially available robotic tissue dissociator |
Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
Sterile tweezers | – | – | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | – |