概要

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Published: August 23, 2022
doi:

概要

Este protocolo demuestra la microinyección de lipopolisacárido en la región ventricular cerebral en un modelo larvario de pez cebra para estudiar la respuesta neuroinflamatoria resultante y la neurotoxicidad.

Abstract

La neuroinflamación es un jugador clave en diversos trastornos neurológicos, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es de gran interés investigar y desarrollar modelos alternativos de neuroinflamación in vivo para comprender el papel de la neuroinflamación en la neurodegeneración. En este estudio, se desarrolló y validó un modelo larval de pez cebra de neuroinflamación mediado por microinyección ventricular de lipopolisacárido (LPS) para inducir una respuesta inmune y neurotoxicidad. Las líneas transgénicas de pez cebra elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se utilizaron para la cuantificación en tiempo real de la viabilidad de las neuronas cerebrales mediante imágenes fluorescentes en vivo integradas con análisis de intensidad de fluorescencia. El comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra se registró automáticamente utilizando una grabadora de seguimiento de video. Se investigó el contenido de óxido nítrico (NO) y los niveles de expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias, incluyendo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral humana α (TNF-α) para evaluar la respuesta inmune inducida por LPS en la cabeza larval del pez cebra. A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral de LPS, se observó pérdida de neuronas y deficiencia de locomoción en larvas de pez cebra. Además, la neuroinflamación inducida por LPS aumentó la liberación de NO y la expresión de ARNm de IL-6, IL-1β y TNF-α en la cabeza de larvas de pez cebra de 6 días después de la fertilización (dpf), y resultó en el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra. En este estudio, la inyección de pez cebra con LPS a una concentración de 2.5-5 mg / ml a 5 dpf se determinó como la condición óptima para este ensayo de neuroinflamación farmacológica. Este protocolo presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para la microinyección de LPS en el ventrículo cerebral para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en una larva de pez cebra, que es útil para estudiar la neuroinflamación y también podría usarse como un ensayo de detección de drogas in vivo de alto rendimiento.

Introduction

La neuroinflamación ha sido descrita como un factor antineurogénico crucial implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central (SNC)1. Después de los insultos patológicos, la neuroinflamación puede resultar en diversas consecuencias adversas, incluyendo la inhibición de la neurogénesis y la inducción de la muerte celular neuronal 2,3. En el proceso subyacente a la respuesta a la inducción de inflamación, múltiples citoquinas inflamatorias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) son secretadas en el espacio extracelular y actúan como componentes cruciales en la muerte neuronal y la supresión de la neurogénesis 4,5,6.

La microinyección de mediadores de la inflamación (como IL-1β, L-arginina y endotoxinas) en el cerebro puede causar reducción de células neuronales y neuroinflamación 7,8,9. El lipopolisacárido (LPS, Figura 1), una endotoxina patógena presente en la pared celular de las bacterias gramnegativas, puede inducir neuroinflamación, exacerbar la neurodegeneración y reducir la neurogénesis en animales10. La inyección de LPS directamente en el SNC del cerebro del ratón aumentó los niveles de óxido nítrico, citoquinas proinflamatorias y otros reguladores11. Además, la inyección estereotáxica de LPS en el entorno cerebral local puede inducir una producción excesiva de moléculas neurotóxicas, lo que resulta en una función neuronal deteriorada y el posterior desarrollo de enfermedades neurodegenerativas 10,12,13,14,15. En el campo de la neurociencia, las observaciones microscópicas vivas y temporales-curso de los procesos celulares y biológicos en organismos vivos son cruciales para comprender los mecanismos subyacentes a la patogénesis y la acción farmacológica16. Sin embargo, la imagen en vivo de modelos de ratón de neuroinflamación y neurotoxicidad está fundamentalmente limitada por la limitada profundidad de penetración óptica de la microscopía, lo que impide la imagen funcional y la observación en vivo de los procesos de desarrollo17,18,19. Por lo tanto, el desarrollo de modelos alternativos de neuroinflamación es de gran interés para facilitar el estudio del desarrollo patológico, y el mecanismo subyacente a la neuroinflamación y la neurodegeneración, mediante imágenes en vivo.

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo prometedor para estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración debido a su sistema inmune innato conservado evolutivamente, transparencia óptica, gran tamaño de embrague embrionario, trazabilidad genética e idoneidad para imágenes in vivo 19,20,21,22,23 . Los protocolos anteriores han inyectado directamente LPS en la yema y el ventrículo del cerebro posterior de larvas de pez cebra sin evaluación mecanicista, o simplemente han agregado LPS al agua de los peces (medio de cultivo) para inducir una respuesta inmune sistémica letal24,25,26,27. Aquí, desarrollamos un protocolo para la microinyección de LPS en los ventrículos cerebrales, para desencadenar una respuesta inmune innata o neurotoxicidad en los 5 días posteriores a la fertilización (dpf) de larvas de pez cebra. Esta respuesta se evidencia por la pérdida de células neuronales, el déficit de comportamiento locomotor, el aumento de la liberación de óxido de nitrito, la activación de la expresión génica inflamatoria y el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra a las 24 h después de la inyección.

Protocol

Las líneas de pez cebra de tipo salvaje AB y pez cebra transgénico elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas Chinas (ICMS). La aprobación ética (UMARE-030-2017) para los experimentos con animales fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad de Macao, y el protocolo sigue las pautas institucionales de cuidado animal. 1. Cría de embriones y larvas de pez cebra Generar embriones de…

Representative Results

El flujo de trabajo descrito aquí presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en larvas de pez cebra. En este protocolo descrito, se inyectaron 5 dpf de pez cebra con LPS (Figura 1) en ventrículos cerebrales utilizando un microinyector (Figura 2A-C). La inyección exitosa en el sitio del ventrículo cerebral se verificó utilizando tinción azul de Evans …

Discussion

Una cantidad creciente de datos epidemiológicos y experimentales implican infecciones bacterianas y virales crónicas como posibles factores de riesgo para enfermedades neurodegenerativas36. La infección desencadena la activación de procesos inflamatorios y respuestas inmunes del huésped37. Incluso si la respuesta actúa como un mecanismo de defensa, la inflamación sobreactivada es perjudicial para la neurogénesis, y el ambiente inflamatorio no permite la supervivenci…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (FDCT) de la RAE de Macao (Ref. FDCT0058/2019/A1 y 0016/2019/AKP), Comité de Investigación, Universidad de Macao (MYRG2020-00183-ICMS y CPG2022-00023-ICMS), y Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

参考文献

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson’s disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson’s disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson’s disease. Parkinson’s Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer’s disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9′-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d’Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer’s disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

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記事を引用
He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

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