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Abstract
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神経科学

Microinjections ventriculaires cérébrales de lipopolysaccharide dans des larves de poisson-zèbre pour évaluer la neuroinflammation et la neurotoxicité

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64313
,
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences,University of Macau, Avenida da Universidade

概要

Ce protocole démontre la micro-injection de lipopolysaccharide dans la région ventriculaire du cerveau dans un modèle larvaire de poisson zèbre pour étudier la réponse neuroinflammatoire et la neurotoxicité qui en résultent.

Abstract

La neuroinflammation est un acteur clé dans divers troubles neurologiques, y compris les maladies neurodégénératives. Par conséquent, il est d’un grand intérêt de rechercher et de développer des modèles alternatifs de neuroinflammation in vivo pour comprendre le rôle de la neuroinflammation dans la neurodégénérescence. Dans cette étude, un modèle larvaire de poisson zèbre de neuroinflammation médiée par microinjection ventriculaire de lipopolysaccharide (LPS) pour induire une réponse immunitaire et une neurotoxicité a été développé et validé. Les lignées de poisson-zèbre transgénique elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP et mpo:EGFP ont été utilisées pour la quantification en temps réel de la viabilité des neurones cérébraux par imagerie en direct par fluorescence intégrée à l’analyse de l’intensité de fluorescence. Le comportement locomoteur des larves de poisson-zèbre a été enregistré automatiquement à l’aide d’un enregistreur de suivi vidéo. La teneur en oxyde nitrique (NO) et les niveaux d’expression de l’ARNm des cytokines inflammatoires, y compris l’interleukine-6 (IL-6), l’interleukine-1β (IL-1β) et le facteur de nécrose tumorale humaine α (TNF-α) ont été étudiés pour évaluer la réponse immunitaire induite par le LPS dans la tête larvaire du poisson zèbre. 24 h après l’injection ventriculaire cérébrale de LPS, une perte de neurones et un déficit de locomotion ont été observés chez les larves de poisson zèbre. De plus, la neuroinflammation induite par le LPS a augmenté la libération de NO et l’expression de l’ARNm de l’IL-6, de l’IL-1β et du TNF-α dans la tête des larves de poisson-zèbre 6 jours après la fécondation (dpf), et a entraîné le recrutement de neutrophiles dans le cerveau du poisson zèbre. Dans cette étude, l’injection de LPS chez le poisson zèbre à une concentration de 2,5 à 5 mg/mL à 5 dpf a été déterminée comme la condition optimale pour ce test pharmacologique de neuroinflammation. Ce protocole présente une nouvelle méthodologie rapide et efficace pour la microinjection de LPS dans le ventricule cérébral afin d’induire une neuroinflammation et une neurotoxicité médiées par le LPS chez une larve de poisson zèbre, ce qui est utile pour étudier la neuroinflammation et pourrait également être utilisé comme test de dépistage de médicaments in vivo à haut débit.

Introduction

La neuroinflammation a été décrite comme un facteur antineurogène crucial impliqué dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives du système nerveux central (SNC)1. Suite à des agressions pathologiques, la neuroinflammation peut entraîner diverses conséquences néfastes, notamment l’inhibition de la neurogenèse et l’induction de la mort cellulaire neuronale 2,3. Dans le processus sous-jacent à la réponse à l’induction de l’inflammation, de multiples cytokines inflammatoires (telles que le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6) sont sécrétées dans l’espace extracellulaire et agissent comme des composants cruciaux dans la mort des neurones et la suppression de la neurogenèse 4,5,6.

La micro-injection de médiateurs de l’inflammation (tels que l’IL-1β, la L-arginine et les endotoxines) dans le cerveau peut provoquer une réduction des cellules neuronales et une neuroinflammation 7,8,9. Le lipopolysaccharide (LPS, Figure 1), une endotoxine pathogène présente dans la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif, peut induire une neuroinflammation, exacerber la neurodégénérescence et réduire la neurogenèse chez les animaux10. L’injection de LPS directement dans le SNC du cerveau de la souris a augmenté les niveaux d’oxyde nitrique, de cytokines pro-inflammatoires et d’autres régulateurs11. De plus, l’injection stéréotaxique de LPS dans l’environnement cérébral local peut induire une production excessive de molécules neurotoxiques, entraînant une altération de la fonction neuronale et le développement ultérieur de maladies neurodégénératives 10,12,13,14,15. Dans le domaine des neurosciences, les observations microscopiques en direct et dans le temps des processus cellulaires et biologiques dans les organismes vivants sont cruciales pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse et à l’action pharmacologique16. Cependant, l’imagerie en direct de modèles murins de neuroinflammation et de neurotoxicité est fondamentalement limitée par la profondeur de pénétration optique limitée de la microscopie, qui empêche l’imagerie fonctionnelle et l’observation en direct des processus de développement17,18,19. Par conséquent, le développement de modèles alternatifs de neuroinflammation est d’un grand intérêt pour faciliter l’étude du développement pathologique et du mécanisme sous-jacent à la neuroinflammation et à la neurodégénérescence par imagerie en direct.

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est apparu comme un modèle prometteur pour étudier la neuroinflammation et la neurodégénérescence en raison de son système immunitaire inné conservé au cours de l’évolution, de sa transparence optique, de sa grande taille d’embrayage embryonnaire, de sa traçabilité génétique et de son aptitude à l’imagerie in vivo 19,20,21,22,23 . Les protocoles précédents ont soit injecté directement du LPS dans le ventricule vitellin et cerveau postérieur des larves de poissons-zèbres sans évaluation mécaniste, soit simplement ajouté du LPS à l’eau de poisson (milieu de culture) pour induire une réponse immunitaire systémique mortelle24,25,26,27. Ici, nous avons développé un protocole de micro-injection de LPS dans les ventricules cérébraux, pour déclencher une réponse immunitaire innée ou une neurotoxicité chez les larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation (dpf). Cette réponse est mise en évidence par la perte de cellules neuronales, le déficit du comportement locomoteur, l’augmentation de la libération d’oxyde de nitrite, l’activation de l’expression génique inflammatoire et le recrutement de neutrophiles dans le cerveau du poisson zèbre 24 h après l’injection.

Protocol

Les lignées de poissons-zèbres de type sauvage AB et de poissons-zèbres transgéniques elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP et mpo:EGFP ont été obtenues auprès de l’Institut des sciences médicales chinoises (ICMS). L’approbation éthique (UMARE-030-2017) pour les expériences sur les animaux a été accordée par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université de Macao, et le protocole suit les directives institutionnelles en matière de soins aux animaux. 1. Élevag…

Representative Results

Le flux de travail décrit ici présente une nouvelle méthodologie rapide et efficace pour induire une neuroinflammation et une neurotoxicité médiées par le LPS chez les larves de poisson zèbre. Dans ce protocole décrit, 5 poissons-zèbres dpf ont été injectés avec du LPS (Figure 1) dans les ventricules cérébraux à l’aide d’un micro-injecteur (Figure 2A-C). La réussite de l’injection dans le site ventricule c?…

Discussion

Un nombre croissant de données épidémiologiques et expérimentales impliquent des infections bactériennes et virales chroniques comme facteurs de risque possibles de maladies neurodégénératives36. L’infection déclenche l’activation des processus inflammatoires et des réponses immunitaires de l’hôte37. Même si la réponse agit comme un mécanisme de défense, l’inflammation suractivée est préjudiciable à la neurogenèse, et l’environnement inflammatoi…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par des subventions du Fonds de développement scientifique et technologique (FDCT) de la RAS de Macao (réf. No. FDCT0058/2019/A1 et 0016/2019/AKP), Comité de recherche, Université de Macao (MYRG2020-00183-ICMS et CPG2022-00023-ICMS) et Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81803398).

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology
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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).
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