הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לתיוג חיסוני של חלבון במקטעי רקמת הלב באמצעות נקודות קוונטיות. טכניקה זו מספקת כלי שימושי כדי לדמיין את לוקליזציה וביטוי תת-תאיים של כל חלבון ברמה האולטרה-סטרוקטורלית.
לוקליזציה תת-תאית היא קריטית לתיחום תפקוד תקין ולקביעת המנגנונים המולקולריים של חלבון מסוים. מספר טכניקות איכותיות וכמותיות משמשות לקביעת לוקליזציה תת-תאית של חלבונים. אחת הטכניקות המתפתחות בקביעת הלוקליזציה התת-תאית של חלבון היא תיוג חיסוני בתיווך QD של חלבון ולאחר מכן הדמיה שלהם במיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). QD הוא ננו-גבישים מוליכים למחצה בעלי תכונה כפולה של מבנה גבישי וצפיפות אלקטרונים גבוהה, מה שהופך אותם לישימים למיקרוסקופיית אלקטרונים. שיטה זו המחישה את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון קולטן סיגמא 1 (Sigmar1) באמצעות QD-TEM ברקמת הלב ברמה האולטרה-סטרוקטורלית. קוביות קטנות של מקטעי רקמת הלב מעכבר מסוג בר היו קבועות ב 3% glutaraldehyde, לאחר מכן osmicated, מוכתם עם אורניל אצטט, ואחריו התייבשות רציפה עם אתנול ואצטון. מקטעי רקמת הלב המיובשים הללו הוטמעו בשרפים אפוקסיים בעלי צמיגות נמוכה, נחתכו למקטעים דקים בעובי 500 ננומטר, הוכנסו לרשת החשמל, ולאחר מכן נחשפו לחשיפת אנטיגן עם 5% נתרן מטאפריוטאט, ולאחר מכן מרווה של שאריות האלדהידים עם גליצין. הרקמות נחסמו, ולאחר מכן דגירה רציפה בנוגדן ראשוני, נוגדן משני ביוטינילציה ו-QD מצומד סטרפטאווידין. חלקים מוכתמים אלה יובשו ככתמים וצולמו בהגדלה גבוהה באמצעות TEM. טכניקת QD-TEM אפשרה הדמיה של לוקליזציה תת-תאית של חלבון Sigmar1 ברמה האולטרה-סטרוקטורלית בלב. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לדמיין את נוכחותו של כל חלבון לוקליזציה תת תאית בכל מערכת איברים.
גוף האדם מורכב מחלבונים רבים האחראים על תפקודים גופניים רבים. הפונקציה של חלבונים תלויה במידה רבה לוקליזציה שלהם באיבר ובאברונים התאיים. מספר טכניקות, כולל פיצול תת-תאי, אימונופלואורסצנציה ומיצוי חלבונים בתיווך דטרגנט, משמשות בדרך כלל לקביעת הלוקליזציה התת-תאיתשל החלבון 1,2. מיקרוסקופיה באמצעות צבע אימונופלואורסצנטי היא השיטה הנפוצה ביותר מבין טכניקות אלה. עם זאת, הצבעים הפלואורסצנטיים המשמשים בטכניקה זו פחות יציבים ונוטים להלבנת תמונות3. טכניקות אחרות כללו מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כדי לדמיין את החלבון ברמה אולטרה-סטרוקטורלית על ידי תיוג חיסוני של חלבונים עם מתכות כבדות צפופות אלקטרונים (זהב, פריטין) או נקודות קוונטיות ננו-גבישים ולאחר מכן הדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM)4,5.
QD הוא ננו-גביש מוליך למחצה המורכב מתרכובות מתכת מוליכות למחצה בעלות תכונות פוטו-לומינסנציה הניתנות לשליטה בעלות משמעות רבה במערכות ביולוגיות3. ננו-גבישים QD מיוצרים בתבנית מעטפת ליבה שבה ננו-גבישים עטופים ביצירת ננו-גבישים כדי להבטיח את יציבותם ותפקודם התקין. שילוב נפוץ של ננו-גבישי קליפת ליבה הם CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS ו-CdTe/CdS/ZnS (ליבה/מעטפת/מעטפת)3. מבין שילובי הננו-גבישים הללו, CdSe/ZnS ו-CdSe/CdS נחקרים במרץ רב ומשמשים לעתים קרובות כנוגדנים משנייםהמצומדים 3,6. לננו-חלקיקי QD אלה יש גם תכונות פלואורסצנטיות עם ספקטרום עירור ופליטה שונה מאשר פלואורופורים מסורתיים. QD משתמש בעירור של אלקטרונים מפס הערכיות בתפזורת כדי להציג תפוקות קוונטיות פלואורסצנטיות גבוהות יותר בהשוואה לפלואורופורים מסורתיים. הסידור הננו-גבישי של מתכות מוליכות למחצה הופך את התיוג בתיווך QD ליציב יותר ועמיד בפני הלבנת פוטו-הלבנה6. בנוסף, ליבת הננו-גבישים ב-QD והמבנה הגבישי שלה מאפשרים ל-QD בגדלים שונים להיות בעלי מגוון רחב של ספקטרום בליעה ופסגות פליטה צרות מאוד7. יתר על כן, חלקיקי QD אלה גדולים מספיק כדי להפיק צפיפות אלקטרונים גבוהה, מה שהופך אותם לשימושיים בטכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה 5,8,9. ננו-גבישי QD אלה זמינים מסחרית גם בגדלים מרובים עם ספקטרום פליטה פלואורסצנטי וצורות שונות, מה שהופך אותם למועמדים מצוינים לתיוג עם נוגדנים מרובים10,11.
טכנולוגיית QD זכתה לחשיבות רבה במחקר הביולוגי בשל תכונות תפקודיות מרובות, כולל שימוש בהדמיית תאים חיים, חקר מנגנוני הובלה בתא, הובלת ממברנה של תנועת הדיפוזיה של החלבון, הטרוגניות תפקודית של תאים וסימון אברונים תוך-תאיים 3,12,13,14,15,16 . QD שימושי גם באבחון מולקולרי למיקוד וגילוי רקמות סרטניות, אפיון הפרופיל המולקולרי של הגידול ומצבו החיסוני, והדמיית גוף הזגוגית והממברנות האפירטינליות 3,17,18. בנוסף, QD יכול לשמש גם בטיפולים רפואיים לטיפול בממאירויות גידול באמצעות טיפול פוטודינמי ואנומליות עיניים על ידי אספקת תרופות לעיניים 3,17,18,19.
באמצעות ננו-גבישי QD שימושיים אלה, המחקר הנוכחי קבע את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון בשם קולטן סיגמא 1 (Sigmar1). Sigmar1 הוא חלבון מלווה מולקולרי רב-משימתי המתבטא בכל מקום. מחקרים מקיפים שהתמקדו בלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1 ברקמות ובאיברים שונים דיווחו על לוקליזציה תת-תאית ספציפית לתאים ולרקמות המעוררת תפקוד מולקולרי20. בתאים שונים (תאי עצב, פוטורצפטור ותאי מערכת החיסון) וברקמות (כבד ומוח) תוך שימוש בגישות ביוכימיות שונות, מחקרים דיווחו על לוקליזציה של Sigmar1 ברשתית אנדופלסמית (ER), קרום ER הקשור למיטוכונדריה (MAM), מעטפת גרעין, קרום פלזמה, רטיקולום נוקלאופלסמי, גרעין ומיטוכונדריה. למרות כל המחקרים הללו, הלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1 בלב נותרה לא ידועה20. לכן, הלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1 ברקמת הלב נקבעה באמצעות תיוג חיסוני בתיווך QD ואחריו הדמיית TEM.
במחקר הנוכחי, תיוג חיסוני בתיווך QD שימש כדי להראות באופן מובהק את הלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1. באמצעות QD, לוקליזציה של Sigmar1 על קרום המיטוכונדריה, במיוחד הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, תוארה ברקמת הלב. בנוסף, Sigmar1 נמצא גם על רשתית סרקופלסמית/אנדופלסמית (S/ER) וליזוזומים ברמה האולטרה-סטרוקטורלית, כפי שניתן לראות באיור 2A-D.
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא שלב חשיפת התחריט או האנטיגן באמצעות תמיסת נתרן מטא-פריודיאט מרוכזת מאוד כדי לחשוף את האנטיגן לאחר קיבוע גלוטרלדהיד ואוסמיקציה. פרוטוקול זה השתמש בטיפול יחיד עם ריכוז גבוה (5%) של נתרן metaperiodate במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זהירות יתרה נדרשת בשלב זה שכן משך זמן ארוך יותר או ריכוז גבוה יותר עבור דגירה של נתרן metaperiodate יגרום צבירה של מבנים, אובדן הגדרת הממברנה עבור האברונים, ולגרום נקבים בסעיף, מה שמקשה על הדמיה של החלבון או המבנה. לחלופין, ניתן להשתמש גם בריכוז נמוך יותר של (3%) תמיסת מטא-פריודייט בשני שלבים למשך 30 דקות במקום ב-5% מטא-פריודיאט. מחקרים הראו כי אפשרות זו מציגה תוצאות דומות כמו עם תמיסת מטא-פריודיאט של 5% עבור דגירה של שלב אחד של 30 דקות. עם זאת, פתרון מטא-פריודיאט של 3% למשך 30 דקות של דגירה במשך פעמיים מספק שליטה טובה יותר על התהליך26,27,28. בתחילה, פרוטוקול זה השתמש דגירה של חלקים עם 10% metaperiodate פתרון במשך 30 דקות. עם זאת, בשל ניקובים רבים מדי שנוצרו במקטע הרקמה על ידי ריכוז זה, הריכוז הסופי ומשך הדגירה של תמיסת המטא-פריודיאט התחדדו והותאמו ל-5% למשך 30 דקות.
צעד נוסף דרש אופטימיזציה של זמן הקיבוע עם glutaraldehyde. קיבוע לא אופטימלי של רקמות גורם לתיוג QD לא מספק, ואילו קיבוע יתר של רקמות גורם לתיוג לא ספציפי גבוה יותר. לכן, יש לשקול היטב את קביעת וטיטרציה של רמה אופטימלית של קיבוע רקמות לסימון נכון וספציפי של חלבונים. בשיטה זו באמצעות רקמות לב, זמן הקיבוע עם glutaraldehyde היה titrated באמצעות 24 שעות ו 48 שעות כנקודות זמן. בהתבסס על תמונות הצביעה של המקטעים הקבועים עבור שתי נקודות הזמן, נמצא כי מקטעים שתוקנו במשך 24 שעות הציגו תוצאות טובות יותר. נכון להיום, ננו-גבישים QD זמינים במספר גדלים, כולל 525, 565, 585, 605, 655 ו-705 ננומטר11,29. לכל אחד מ-QD אלה יש ספקטרום פליטה משלו והוא פולט פלואורסצנטיות באורכי גל שונים. בנוסף, QDs אלה הזמינים מסחרית בגדלים שונים מציגים צורות שונות; לדוגמה, QD 525, 565 ו- 585 הם כדוריים כמעט בגדלים שונים, ואילו QD 605, 655 ו- 705 הם בעלי צורה מלבנית לא סדירה. מבין ננו-גבישי QD שונים אלה, QD 525, 565 ו-655 ניתנים להבחנה בקלות זה מזהב-11,29. הבדלים אלה בספקטרום הפליטה ובצורות הופכים את QD למועמד מצוין לתיוג מרובה של חלבונים ולהדמיה על ידי פלואורסצנציה ומיקרוסקופיית אלקטרונים. במחקר זה, QD זמין מסחרית, QD 655, שימש לתיוג החלבון Sigmar1 כדי להבדיל אותו מכל רקע לא ספציפי במקטעים המוכתמים.
מקבילה נוספת של QD לתיוג חלבונים במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה היא חלקיק אימונוגולד. חלקיקי האימונוגולד משמשים באופן מסורתי לתיוג חלבונים למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. חלקיקי זהב אלה צפופים מאוד באלקטרונים וניתנים לזיהוי בקלות בהשוואה לננו-גבישים QD. עם זאת, QD מפגין יעילות טובה יותר עם חדירה טובה יותר ברקמות, יציבות וחיי מדף גבוהים יותר, ושמירה טובה יותר של רכיבים אולטרה-סטרוקטורליים, מה שהופך אותם למועמדים טובים יותר לסימון חלבונים 4,5. ל-QD יש גם יכולת ייחודית להתגלות הן על ידי מיקרוסקופיית אור והן על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים, מה שמוסיף לערכו על פני תיוג אימונוגולד10.
מגבלה אחת של תיוג חיסוני זה בתיווך QD היא השימוש באוסמיום טטרוקסיד במהלך העיבוד. אוסמיום טטרוקסיד משמש להגדלת צפיפות האלקטרונים, מוליכות וניגודיות של מבני ממברנה ביולוגית פחות צפופים באלקטרונים ופחות מנוגדים 5,30. עם זאת, השימוש באוסמיום טטרוקסיד באופן מיידי ובלתי הפיך הורס את התכונה של הדגימה כדי ליצור פלואורסצנציה כאשר היא מסומנת ב- QD6. זה מגביל את השימוש ב- QD במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. גישה חלופית המשמיטה את השימוש באוסמיום טטרוקסיד תהיה יתרון בשמירה על התכונות הפלואורסצנטיות ומכאן היישום הכפול של תיוג חיסוני בתיווך QD. לחלק מהדגמים החדשים יותר של TEM יש אפשרות לחבר את מערכת ניתוח קרני הרנטגן פיזור האנרגיה (EDX) המאפשרת זיהוי של הרכב היסודות של חומרים. מגבלה נוספת של המחקר היא היעדר מיפוי יסודי של מדגם וניתוח תמונה באמצעות EDX. לכן, מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בניתוח EDX של ספקטרום QD כדי לנתח את הרכב היסודות.
תיוג QD של חלבונים זכה לתשומת לב רבה בתקופה האחרונה. QD מציעה מספר יישומים ויתרונות הן במחקר ביולוגי והן בטיפולים רפואיים. QD עטוף בנוסף בליגנד פולידנטי מפגין יציבות מוגברת השומרת על התפוקה הקוונטית. יתר על כן, עטיפת QD עם חומרים חיוביים ביולוגיים אלה גם מגבירה את הזמינות הביולוגית שלו ברקמות מה שהופך אותו למועמד טוב ליישום פוטנציאלי באיתור גידולים, הדמיית תאים חיים, אספקת תרופות והדמיית רקמות 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 ו- R01HL152723; פרס קו הסיום של LSUHSC-S CCDS, פרס מחקר COVID-19 ופרס מחקר LARC ל- MSB; מלגת LSUHSC-S מלקולם פייסט קרדיווסקולרי ופוסט-דוקטורט AHA ל- CSA (20POST35210789); ומלגת קדם-דוקטורט של LSUHSC-S מלקולם פייסט ל-RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |