本协议描述了一种使用量子点在心脏组织切片中免疫标记蛋白质的方法。该技术提供了一种有用的工具,可以在超微结构水平上可视化任何蛋白质的亚细胞定位和表达。
亚细胞定位对于描述特定蛋白质的正常功能和确定分子机制至关重要。几种定性和定量技术用于确定蛋白质的亚细胞定位。确定蛋白质亚细胞定位的新兴技术之一是量子点(QD)介导的蛋白质免疫标记,然后用透射电子显微镜(TEM)对其进行成像。QD是一种半导体纳米晶体,具有晶体结构和高电子密度的双重性质,使其适用于电子显微镜。目前的方法在超微结构水平上使用QD-TEM在心脏组织中可视化Sigma 1受体(Sigmar1)蛋白的亚细胞定位。将来自野生型小鼠的心脏组织切片的小立方体固定在3%戊二醛中,随后渗透,用乙酸铀酰染色,然后用乙醇和丙酮顺序脱水。将这些脱水的心脏组织切片嵌入低粘度环氧树脂中,切成500nm厚的薄切片,放在网格上,随后用5%偏高碘酸钠进行抗原揭开,然后用甘氨酸淬灭残留醛。封闭组织,然后在一抗、生物素化二抗和链霉亲和素偶联QD中依次孵育。将这些染色切片进行印迹干燥并使用TEM在高放大倍率下成像。QD-TEM技术允许在心脏的超微结构水平上可视化 Sigmar1蛋白的亚细胞定位。这些技术可用于可视化任何器官系统中任何蛋白质和亚细胞定位的存在。
人体由许多蛋白质组成,负责许多身体机能。蛋白质的功能在很大程度上取决于它们在器官和细胞器中的定位。几种技术,包括亚细胞分离、免疫荧光和洗涤剂介导的蛋白质提取,通常用于确定蛋白质的亚细胞定位1,2。使用免疫荧光染料的显微镜是这些技术中使用最广泛的方法。然而,该技术中使用的荧光染料不太稳定,并且容易发生光漂白3。其他技术涉及高分辨率显微镜,通过用电子致密重金属(金、铁蛋白)或量子点纳米晶体对蛋白质进行免疫标记,然后在超微结构水平上可视化蛋白质,然后使用透射电子显微镜(TEM)4,5。
QD是由半导体金属化合物组成的半导体纳米晶,具有可控的光致发光性能,在生物系统中具有重要意义3。QD纳米晶体以核壳形式制成,其中纳米晶体被封装在纳米晶体的形成中,以确保其适当的稳定性和功能。常用的核壳纳米晶体组合是CdSe/ZnS,CdSe / CdS CdSe / ZnSe,CdTe / CdS,CdTe / ZnS和CdTe / CdS / ZnS(核/壳/壳)3。在这些纳米晶体组合中,CdSe/ZnS和CdSe/CdS的研究最为活跃,并经常用作二抗偶联物3,6。这些QD纳米颗粒还具有与传统荧光团不同的激发和发射光谱的荧光特性。与传统荧光团相比,QD利用本体价带激发电子,表现出更高的荧光量子产率。半导体金属的纳米晶体排列使QD介导的标记更加稳定和耐光漂白6。此外,QD中的纳米晶芯及其晶体结构允许不同尺寸的QD具有宽范围的吸收光谱和非常窄的发射峰7。此外,这些QD颗粒足够大以产生高电子密度,使它们可用于高分辨率显微镜技术,包括透射电子显微镜5,8,9。这些QD纳米晶体还具有多种尺寸,具有不同的荧光发射光谱和形状,使其成为用多种抗体标记10,11的绝佳候选者。
QD技术具有多种功能特性,包括用于活细胞成像,研究细胞中的运输机制,蛋白质扩散运动的膜转运,细胞的功能异质性以及细胞内细胞器的标记3,12,13,14,15,16,QD技术在生物学研究中具有重要意义.QD还可用于分子诊断,用于靶向和检测癌症组织,表征肿瘤的分子谱和免疫状态,以及可视化玻璃体和视网膜前膜3,17,18。此外,QD还可用于医学治疗,通过光动力疗法治疗肿瘤恶性肿瘤,并通过向眼睛输送药物来治疗眼科异常3,17,18,19。
利用这些非常有用的QD纳米晶体,本研究确定了名为Sigma 1受体(Sigmar1)的蛋白质的亚细胞定位。Sigmar1是一种普遍表达的多任务分子伴侣蛋白。针对Sigmar1在不同组织和器官中的亚细胞定位的广泛研究报告了引起分子功能的细胞和组织类型特异性亚细胞定位20。在使用不同生化方法的不同细胞(神经元、光感受器和免疫细胞)和组织(肝脏和大脑)中,研究报告了 Sigmar1 在内质网 (ER)、线粒体相关 ER 膜 (MAM)、核包膜、质膜、核质网、细胞核和线粒体上的定位。尽管进行了所有这些研究,但Sigmar1在心脏中的亚细胞定位仍然未知20。因此,使用QD介导的免疫标记和TEM成像确定Sigmar1在心脏组织中的亚细胞定位。
在本研究中,QD介导的免疫标记用于独特地显示Sigmar1的亚细胞定位。使用QD,Sigmar1在线粒体膜上的定位,特别是线粒体内膜,被描绘在心脏组织中。此外,还发现Sigmar1位于肌质/内质网(S/ER)和超微结构水平的溶酶体上,如图2A-D所示。
该方案中的一个关键步骤是使用高浓度的偏高碘酸钠溶液进行蚀刻或抗原揭开步骤,以在戊二醛固定和渗透后揭开抗原。该方案在室温下使用高浓度(5%)偏高碘酸钠的单次处理30分钟。此步骤需要格外小心,因为偏高碘酸钠孵育的持续时间较长或浓度较高会导致结构聚集,细胞器膜清晰度丧失,并导致切片穿孔,难以可视化蛋白质或结构。或者,也可以使用较低浓度的(3%)偏高碘酸盐溶液分两步30分钟代替5%偏高碘酸盐。研究表明,这种选择与5%偏高碘酸盐溶液进行一步30分钟孵育的结果相似。然而,3%偏高碘酸盐溶液孵育30分钟两次提供了对过程的更好控制26,27,28。最初,该协议使用用10%偏高碘酸盐溶液孵育切片30分钟。然而,由于该浓度在组织切片中产生的穿孔过多,间高碘酸盐溶液的最终浓度和孵育持续时间逐渐减少并优化至5%30分钟。
另一个步骤需要用戊二醛优化固定时间。组织固定欠佳导致QD标记不足,而组织过度固定导致非特异性标记较高。因此,在确定和滴定最佳组织固定水平时,必须仔细考虑正确和特异性的蛋白质标记。在该方法中使用心脏组织,以24小时和48小时为时间点滴定戊二醛固定时间。基于两个时间点固定切片的染色图像,发现固定24小时的切片显示出更好的结果。迄今为止,QD纳米晶体有多种尺寸可供选择,包括525、565、585、605、655和705 nm11,29。这些QD中的每一个都有自己的发射光谱,并发出不同波长的荧光。此外,这些不同尺寸的市售量子点显示出不同的形状;例如,QD 525、565 和 585 实际上是不同尺寸的球形,而 QD 605、655 和 705 是不规则的长方形。在这些不同的QD纳米晶体中,QD 525,565和655很容易彼此区分11,29。发射光谱和形状的这些差异使QD成为蛋白质多重标记以及荧光和电子显微镜可视化的绝佳候选者。在这项研究中,使用市售QD 655标记Sigmar1蛋白,以将其与染色切片中的任何非特异性背景区分开来。
在高分辨率显微镜中用于蛋白质标记的QD的另一个对应物是免疫金颗粒。免疫金颗粒传统上用于标记用于高分辨率显微镜的蛋白质。与QD纳米晶体相比,这些金颗粒具有高电子密度且易于识别。然而,QD表现出更高的效率,更好的组织渗透性,更高的稳定性和保质期,以及更好的超微结构组分保留,使其成为蛋白质标记的更好候选者4,5。QD还具有通过光学和电子显微镜检测的独特能力,这增加了其相对于免疫金标记10的价值。
这种QD介导的免疫标记的一个局限性是在加工过程中使用四氧化锇。四氧化锇用于增加电子密度较低且对比度较低的生物膜结构的电子密度、电导率和对比度5,30。然而,当用QD6标记时,使用四氧化锇会瞬间且不可逆地破坏样品的性质以产生荧光。这限制了QD在荧光显微镜中的使用。一种不使用四氧化锇的替代方法将有利于保留荧光特性,从而有利于QD介导的免疫标记的双重应用。一些较新的TEM型号可以选择连接能量色散X射线分析(EDX)系统,该系统可以识别材料的元素组成。该研究的另一个局限性是缺乏使用EDX的样品和图像分析的元素映射。因此,未来的研究应侧重于QD光谱的EDX分析,以分析元素组成。
蛋白质的QD标记近年来引起了很多关注。QD在生物研究和医学治疗方面具有多种应用和优势。另外用聚齿状配体包裹的QD表现出更高的稳定性,保持了量子产率。此外,用这些生物有利试剂包封QD也增加了其在组织中的生物利用度,使其成为检测肿瘤,活细胞成像,药物递送和组织成像的潜在应用的良好候选者3,31,32。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国国立卫生研究院资助的支持:R01HL145753、R01HL145753-01S1、R01HL145753-03S1和R01HL152723;MSB获得LSUHSC-S CCDS终点线奖,COVID-19研究奖和LARC研究奖;LSUHSC-S Malcolm Feist 心血管和 AHA CSA 博士后奖学金 (20POST35210789);和 LSUHSC-S Malcolm Feist 博士前奖学金到 RA。
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |