Het huidige protocol beschrijft een methode voor het immuno-labelen van een eiwit in de hartweefselsecties met behulp van quantum dots. Deze techniek biedt een handig hulpmiddel om de subcellulaire lokalisatie en expressie van elk eiwit op ultrastructureel niveau te visualiseren.
De subcellulaire lokalisatie is van cruciaal belang voor het afbakenen van de juiste functie en het bepalen van de moleculaire mechanismen van een bepaald eiwit. Verschillende kwalitatieve en kwantitatieve technieken worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen. Een van de opkomende technieken bij het bepalen van de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is quantum dots (QD) -gemedieerde immunolabeling van een eiwit gevolgd door beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). QD is een halfgeleider nanokristal met een dubbele eigenschap van kristallijne structuur en hoge elektronendichtheid, waardoor ze toepasbaar zijn op elektronenmicroscopie. Deze huidige methode visualiseerde de subcellulaire lokalisatie van Sigma 1 receptor (Sigmar1) eiwit met behulp van QD-TEM in het hartweefsel op ultrastructureel niveau. Kleine blokjes van de hartweefselsecties van een wildtype muis werden gefixeerd in 3% glutaaraldehyde, vervolgens gefixeerd, gekleurd met uranylacetaat, gevolgd door sequentiële dehydratie met ethanol en aceton. Deze gedehydrateerde hartweefselsecties werden ingebed in epoxyharsen met een lage viscositeit, gesneden in dunne secties van 500 nm dikte, op het rooster geplaatst en vervolgens onderworpen aan antigeenontmaskering met 5% natriummetaperiodaat, gevolgd door het blussen van de resterende aldehyden met glycine. De weefsels werden geblokkeerd, gevolgd door sequentiële incubatie in primair antilichaam, gebiotinyleerd secundair antilichaam en streptavidin-geconjugeerde QD. Deze bevlekte secties werden vlekkerdroog en bij hoge vergroting in beeld gebracht met TEM. De QD-TEM-techniek maakte de visualisatie van de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1-eiwit op ultrastructureel niveau in het hart mogelijk. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van elk eiwit en subcellulaire lokalisatie in elk orgaansysteem te visualiseren.
Het menselijk lichaam bestaat uit vele eiwitten die verantwoordelijk zijn voor tal van lichaamsfuncties. De functie van eiwitten hangt grotendeels af van hun lokalisatie in het orgaan en cellulaire organellen. Verschillende technieken, waaronder subcellulaire fractionering, immunofluorescentie en detergent-gemedieerde eiwitextractie, worden vaak gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van het eiwit te bepalen 1,2. Microscopie met immunofluorescente kleurstof is de meest gebruikte methode onder deze technieken. De fluorescerende kleurstoffen die bij deze techniek worden gebruikt, zijn echter minder stabiel en vatbaar voor fotobleaching3. Andere technieken omvatten microscopie met hoge resolutie om het eiwit op ultrastructureel niveau te visualiseren door eiwitten te immunolabelen met elektrondichte, zware metalen (goud, ferritine) of quantum dots nanokristallen en gevolgd door ze te visualiseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)4,5.
QD is een halfgeleider nanokristal samengesteld uit halfgeleidermetaalverbindingen met controleerbare fotoluminescentie-eigenschappen die een grote betekenis hebben in biologische systemen3. QD-nanokristallen worden gemaakt in een core-shell-formaat waarbij een nanokristal is ingekapseld in de vorming van nanokristallen om hun juiste stabiliteit en werking te garanderen. Veelgebruikte core-shell nanokristallen combinatie zijn CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS en CdTe/CdS/ZnS (core/shell/shell)3. Van deze nanokristalcombinaties worden CdSe/ZnS en CdSe/CdS het krachtigst bestudeerd en vaak gebruikt als secundaire antilichaamconjugaten 3,6. Deze QD-nanodeeltjes bezitten ook fluorescerende eigenschappen met andere excitatie- en emissiespectra dan traditionele fluoroforen. QD maakt gebruik van de excitatie van elektronen uit de bulkvalentieband om hogere fluorescentie-kwantumopbrengsten te vertonen in vergelijking met traditionele fluoroforen. De nanokristalschikking van halfgeleidermetalen maakt QD-gemedieerde etikettering stabieler en bestand tegen fotobleaching6. Bovendien zorgt de nanokristalkern in QD en zijn kristallijne structuur ervoor dat QD van verschillende groottes een breed scala aan absorptiespectra en zeer smalle emissiepieken heeft7. Bovendien zijn deze QD-deeltjes groot genoeg om een hoge elektronendichtheid te produceren, waardoor ze nuttig zijn bij microscopietechnieken met hoge resolutie, waaronder transmissie-elektronenmicroscopie 5,8,9. Deze QD nanokristallen zijn ook in de handel verkrijgbaar in meerdere maten met verschillende fluorescentie-emissiespectra en -vormen, waardoor ze een uitstekende kandidaat zijn voor etikettering met meerdere antilichamen10,11.
QD-technologie werd van groot belang in biologisch onderzoek vanwege meerdere functionele eigenschappen, waaronder gebruik in live-cell imaging, de studie van transportmechanismen in de cel, membraantransport van de diffusiebeweging van eiwitten, functionele heterogeniteit van cellen en markering van intracellulair organel 3,12,13,14,15,16 . QD is ook nuttig in moleculaire diagnostiek voor het richten en detecteren van kankerweefsels, het karakteriseren van het moleculaire profiel en de immuunstatus van de tumor en het visualiseren van glasachtig lichaam en epiretinale membranen 3,17,18. Daarnaast kan QD ook worden gebruikt in medische therapieën voor de behandeling van tumormaligniteiten via fotodynamische therapie en oogheelkundige anomalieën door geneesmiddelen aan de ogen toe te dienen 3,17,18,19.
Met behulp van deze zeer nuttige QD-nanokristallen bepaalde de huidige studie de subcellulaire lokalisatie van een eiwit genaamd Sigma 1-receptor (Sigmar1). Sigmar1 is een alomtegenwoordig tot expressie gebracht multitaskend moleculair chaperonne-eiwit. Uitgebreide studies gericht op sigmar1’s subcellulaire lokalisatie in verschillende weefsels en organen rapporteerden een cel- en weefseltype specifieke subcellulaire lokalisatie die moleculaire functie uitlokt20. In verschillende cellen (neuronale, fotoreceptor- en immuuncellen) en weefsels (lever en hersenen) met behulp van verschillende biochemische benaderingen, rapporteerden studies de lokalisatie van Sigmar1 op endoplasmatisch reticulum (ER), mitochondria-geassocieerd ER-membraan (MAM), nucleaire envelop, plasmamembraan, nucleoplasmatisch reticulum, kern en mitochondriën. Ondanks al deze studies bleef de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1 in het hart onbekend20. Daarom werd de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1 in hartweefsel bepaald met behulp van de QD-gemedieerde immunolabeling gevolgd door TEM-beeldvorming.
In de huidige studie werd QD-gemedieerde immunolabeling gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van Sigmar1 onderscheidend aan te tonen. Met behulp van QD werd de lokalisatie van Sigmar1 op het mitochondriale membraan, met name het binnenste mitochondriale membraan, afgebeeld in hartweefsel. Bovendien bleek Sigmar1 zich ook te bevinden op sarcoplasmatisch/endoplasmatisch reticulum (S/ER) en lysosomen op ultrastructureel niveau, zoals weergegeven in figuur 2A-D.
Een cruciale stap in dit protocol is de stap van het etsen of ontmaskeren van antigeen met behulp van sterk geconcentreerde natriummetaperiodaatoplossing om het antigeen te ontmaskeren na glutaaraldehydefixatie en osmicatie. Dit protocol gebruikte een enkele behandeling met een hoge concentratie (5%) natriummetaperiodaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Extra zorg is nodig in deze stap, omdat een langere duur of hogere concentratie voor natriummetaperiodaatincubatie zal resulteren in aggregatie van structuren, verlies van membraandefinitie voor de organellen en perforaties in de sectie zal veroorzaken, waardoor het moeilijk wordt om het eiwit of de structuur te visualiseren. Als alternatief kan ook een lagere concentratie (3%) metaperiodaetoplossing in twee stappen gedurende 30 minuten worden gebruikt in plaats van 5% metaperiodaat. Studies hebben aangetoond dat deze optie vergelijkbare resultaten vertoont als met 5% metaperiodate-oplossing voor eenstaps incubatie van 30 minuten. Een 3% metaperiodate-oplossing voor 30 minuten incubatie gedurende twee keer biedt echter een betere controle over het proces 26,27,28. Aanvankelijk gebruikte dit protocol incubatie van de secties met 10% metaperiodaet-oplossing gedurende 30 minuten. Vanwege te veel perforaties die door deze concentratie in het weefselgedeelte werden gecreëerd, werd de uiteindelijke concentratie en incubatieduur van de metaperiodaatoplossing echter afgebouwd en geoptimaliseerd tot 5% gedurende 30 minuten.
Een andere stap vereiste optimalisatie van de fixatietijd met glutaaraldehyde. Suboptimale fixatie van weefsels resulteert in onvoldoende QD-etikettering, terwijl overfixatie van weefsels resulteert in hogere niet-specifieke etikettering. Daarom moet zorgvuldig worden overwogen bij het bepalen en titreren van een optimaal niveau van weefselfixatie voor een goede en specifieke etikettering van eiwitten. Bij deze methode met hartweefsels werd de fixatietijd met glutaaraldehyde getitreerd met 24 uur en 48 uur als tijdstippen. Op basis van de kleuringsbeelden van de secties die voor beide tijdstippen waren vastgesteld, bleek dat secties die gedurende 24 uur waren vastgesteld, betere resultaten vertoonden. Tot op heden zijn QD nanokristallen verkrijgbaar in meerdere maten, waaronder 525, 565, 585, 605, 655 en 705 nm11,29. Elk van deze QD heeft zijn eigen emissiespectra en zendt fluorescentie uit op verschillende golflengten. Bovendien geven deze in de handel verkrijgbare QD’s van verschillende groottes verschillende vormen weer; QD 525, 565 en 585 zijn bijvoorbeeld vrijwel bolvormig met verschillende maten, terwijl QD 605, 655 en 705 onregelmatig langwerpig van vorm zijn. Van deze verschillende QD nanokristallen zijn QD 525, 565 en 655 gemakkelijk van elkaarte onderscheiden 11,29. Deze verschillen in emissiespectra en -vormen maken QD een geweldige kandidaat voor multi-labeling van eiwitten en visualisatie door fluorescentie en elektronenmicroscopie. In deze studie werd een in de handel verkrijgbare QD, QD 655, gebruikt om het Sigmar1-eiwit te labelen om het te onderscheiden van elke niet-specifieke achtergrond in de gekleurde secties.
Een andere tegenhanger van QD voor eiwitetikettering in hoge resolutie microscopie is het immunogouddeeltje. De immunogolddeeltjes worden traditioneel gebruikt om eiwitten te labelen voor microscopie met hoge resolutie. Deze gouddeeltjes zijn zeer elektrondicht en gemakkelijk identificeerbaar in vergelijking met QD-nanokristallen. QD vertoont echter een betere efficiëntie met een betere penetratie in weefsels, een hogere stabiliteit en houdbaarheid en een betere retentie van ultrastructurele componenten, waardoor ze een betere kandidaat zijn voor eiwitetikettering 4,5. QD heeft ook een uniek vermogen om te worden gedetecteerd door zowel licht- als elektronenmicroscopie, wat bijdraagt aan zijn waarde ten opzichte van immunogold-etikettering10.
Een beperking van deze QD-gemedieerde immunolabeling is het gebruik van osmiumtetroxide tijdens de verwerking. Osmiumtetroxide wordt gebruikt om de elektronendichtheid, geleidbaarheid en het contrast van anders minder elektrondichte en minder contrasterende biologische membraanstructuren te verhogen 5,30. Het gebruik van osmiumtetroxide vernietigt echter onmiddellijk en onomkeerbaar de eigenschap van het monster om fluorescentie te creëren wanneer het wordt gelabeld met QD6. Dit beperkt het gebruik van QD in fluorescentiemicroscopie. Een alternatieve benadering waarbij het gebruik van osmiumtetroxide wordt weggelaten, zal voordelig zijn om de fluorescerende eigenschappen te behouden en dus de dubbele toepassing van QD-gemedieerde immunolabeling. Sommige van de nieuwere modellen van TEM hebben de mogelijkheid om het Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDX) -systeem te bevestigen dat identificatie van de elementaire samenstelling van materialen mogelijk maakt. Een andere beperking van de studie is het ontbreken van elementaire mapping van een steekproef en beeldanalyse met behulp van EDX. Daarom moeten toekomstige studies zich richten op de EDX-analyse van de QD-spectra om de elementaire samenstelling te analyseren.
QD-etikettering van eiwitten heeft de afgelopen tijd veel aandacht gekregen. QD biedt verschillende toepassingen en voordelen in zowel biologisch onderzoek als medische therapieën. QD wordt bovendien omwikkeld met polydentaatligand en vertoont een verhoogde stabiliteit om de kwantumopbrengst te behouden. Verder verhoogt het inkapselen van QD met deze bio-gunstige middelen ook de biologische beschikbaarheid in weefsels, waardoor het een goede kandidaat is voor potentiële toepassing bij het detecteren van tumoren, live-cell imaging, medicijnafgifte en weefselbeeldvorming 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 en R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award en LARC Research Award aan MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Cardiovasculaire en AHA Postdoctorale Fellowship voor CSA (20POST35210789); en LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship aan RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |