概要

Un modelo competente de hepatocitos que examina la entrada del virus de la hepatitis B a través del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio como objetivo terapéutico

Published: May 10, 2022
doi:

概要

Presentamos un protocolo para detectar compuestos contra el virus de la hepatitis B (VHB) dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada pre y post-viral, utilizando calorimetría de titulación isotérmica para medir la afinidad de unión (KD) con el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio del huésped. La eficacia antiviral se determinó a través de la supresión de los marcadores del ciclo de vida viral (formación de ADNcc, transcripción y ensamblaje viral).

Abstract

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se ha considerado un factor de riesgo crucial para el carcinoma hepatocelular. El tratamiento actual solo puede disminuir la carga viral, pero no puede dar lugar a una remisión completa. Un modelo de hepatocitos eficiente para la infección por VHB ofrecería un ciclo de vida viral fiel a la vida que sería crucial para la detección de agentes terapéuticos. La mayoría de los agentes anti-VHB disponibles se dirigen a las etapas del ciclo de vida después de la entrada viral, pero no antes de la entrada viral. Este protocolo detalla la generación de un modelo de hepatocitos competente capaz de detectar agentes terapéuticos dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada previral y posterior a la entrada viral. Esto incluye la orientación de la unión del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP), la formación de cccDNA, la transcripción y el ensamblaje viral basado en imHC o HepaRG como células huésped. Aquí, el ensayo de inhibición de entrada del VHB utilizó curcumina para inhibir las funciones de unión y transporte del VHB a través de NTCP. Los inhibidores se evaluaron para determinar la afinidad de unión (KD) con NTCP utilizando calorimetría de titulación isotérmica (ITC), una herramienta universal para la detección de fármacos contra el VHB basada en parámetros termodinámicos.

Introduction

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se considera una enfermedad potencialmente mortal en todo el mundo. La infección crónica por VHB está cargada de riesgo de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular1. El tratamiento actual contra el VHB se centra principalmente en la entrada después de la viral utilizando análogos de nucleólidos (NA) e interferón-alfa (IFN-α)2,3. El descubrimiento de un inhibidor de la entrada del VHB, Myrcludex B, ha identificado un nuevo objetivo para los agentes anti-VHB4. La combinación de inhibidores de entrada y NAs en el VHB crónico ha disminuido significativamente la carga viral en comparación con aquellos dirigidos a la replicación viral sola 5,6. Sin embargo, el modelo clásico de hepatocitos para el cribado de los inhibidores de la entrada al VHB está limitado por los bajos niveles de receptores virales (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, NTCP). La sobreexpresión de hNTCP en células hepatomas (es decir, HepG2 y Huh7) mejora la infectividad del VHB 7,8. Sin embargo, estas líneas celulares expresan bajos niveles de enzimas metabolizadoras de fármacos de fase I y II y exhiben inestabilidad genética9. Los modelos de hepatocitos que pueden ayudar a atacar distintos mecanismos de compuestos candidatos contra el VHB, como la entrada previral, la unión a NTCP y la entrada viral, acelerarían la identificación y el desarrollo de regímenes de combinación eficaces. El estudio de la actividad anti-VHB de la curcumina ha dilucidado la inhibición de la entrada viral como un nuevo mecanismo además de la interrupción posterior a la entrada viral. Este protocolo detalla un modelo de huésped para el cribado de moléculas de entrada anti-VHB10.

El objetivo de este método es explorar compuestos candidatos anti-VHB para la inhibición de la entrada viral, especialmente bloqueando la unión y el transporte de NTCP. Como la expresión de NTCP es un factor crítico para la entrada e infección del VHB, optimizamos el protocolo de maduración de hepatocitos para maximizar los niveles de NTCP11. Además, este protocolo puede diferenciar el efecto inhibitorio sobre la entrada del VHB como inhibición de la unión al VHB versus inhibición de la internalización. El ensayo de captación de ácido taurocólico (TCA) también se modificó utilizando un método basado en ELISA en lugar de un radioisótopo para representar el transporte NTCP12,13. La interacción receptor y ligando fue confirmada por sus estructuras 3D14,15. La inhibición de la función NTCP puede ser evaluada midiendo la actividad de captación de TCA16. Sin embargo, esta técnica no proporcionó evidencia directa de unión de NTCP a los inhibidores candidatos. Por lo tanto, la unión puede investigarse utilizando diversas técnicas, como la resonancia de plasmones de superficie17, ELISA, ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen y varios otros métodos20. Entre estas técnicas, el ITC es un estándar objetivo en el análisis de unión porque puede observar la absorción o emisión de calor en casi todas las reacciones21. La afinidad de unión (KD) de NTCP y compuestos candidatos se evaluó directamente mediante ITC; Esos valores de afinidad fueron más precisos que los obtenidos utilizando el modelo de predicción in silico 22.

Este protocolo cubre técnicas de maduración de hepatocitos, infección por VHB y detección de inhibidores de la entrada de VHB. Brevemente, se desarrolló un modelo de hepatocitos basado en líneas celulares imHC y HepaRG. Las células cultivadas se diferenciaron en hepatocitos maduros en 2 semanas. La regulación positiva de los niveles de NTCP se detectó mediante PCR en tiempo real, western blot y citometría de flujo11. El virión de la hepatitis B (VHBcc) se produjo y recolectó de HepG2.2.15. El imHC o HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) fue tratado profilácticamente con los candidatos anti-VHB 2 h antes de la inoculación con virión VHB. El resultado esperado del experimento fue la identificación de los agentes que disminuyen el VHB celular y la infectividad. La actividad anti-NTCP se evaluó mediante el ensayo de captación de TCA. La actividad de NTCP podría ser suprimida por los agentes que se unieron específicamente a NTCP. La técnica ITC fue empleada para investigar la factibilidad de la unión interactiva que podría predecir inhibidores y sus proteínas diana, determinando la afinidad de unión (KD) del ligando para el receptor a través de interacciones no covalentes del complejo biomolecular23,24. Por ejemplo, K D ≥ 1 × 103 mM representa una unión débil, K D ≥ 1 × 106 μM representa una unión moderada y K D ≤ 1 × 109 nM representa una unión fuerte. El ΔG está directamente correlacionado con las interacciones de unión. En particular, una reacción con ΔG negativo es una reacción exergónica, lo que indica que la unión es un proceso espontáneo. Una reacción con un ΔH negativo indica que los procesos de unión dependen del enlace de hidrógeno y de las fuerzas de Van der Waals. Tanto la captación de TCA como los datos del ITC podrían utilizarse para detectar agentes de entrada anti-VHB. Los resultados de estos protocolos pueden proporcionar una base no solo para la detección contra el VHB, sino también para la interacción con NTCP evaluada a través de la afinidad vinculante y la función de transporte. Este documento describe la preparación y caracterización de la célula huésped, el diseño experimental y la evaluación de la entrada anti-VHB junto con la afinidad de unión a NTCP.

Protocol

NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en una campana de flujo de riesgo biológico de Clase II o en una campana de flujo laminar. El manejo del VHB fue aprobado éticamente por el IRB (MURA2020/1545). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todas las soluciones, reactivos, equipos y líneas celulares utilizadas en este protocolo. 1. Preparación de células huésped (hepatocitos maduros) Cultivar hepatocitos (3,75 ?…

Representative Results

Se observaron características de maduración hepática, incluyendo células binucleadas y morfología de forma poligonal (Figura 1), especialmente en la etapa diferenciada de imHC (Figura 1A). Se midió un gran aumento en la expresión de NTCP en d-HepaRG y d-imHC a 7 veces y 40 veces, respectivamente (Figura 1B). La forma altamente glicosilada de NTCP, postulada para conferir susceptibilidad a la entrada de VHB, se detectó más e…

Discussion

La infección por VHB se inicia a través de la unión de baja afinidad a proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en los hepatocitos25, seguida de la unión a NTCP con posterior internalización a través de endocitosis26. Como el NTCP es un receptor crucial para la entrada del VHB, la entrada dirigida al VHB puede traducirse clínicamente para disminuir la infección de novo , la transmisión maternoinfantil (MTCT) y la recurrencia después del trasplante de hí…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad de Mahidol y la Investigación e Innovación Científica de Tailandia (TSRI) otorgados por separado a A. Wongkajornsilp y K. Sa-ngiamsuntorn. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Oficina del Consejo Nacional de Políticas de Investigación e Innovación en Ciencias de la Educación Superior a través de la Unidad de Gestión de Programas para la Competitividad (número de subvención C10F630093). A. Wongkajornsilp recibió una beca Chalermprakiat de la Facultad de Medicina del Hospital Siriraj de la Universidad de Mahidol. Los autores desean agradecer a la señorita Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Facultad de Ciencias, Universidad de Mahidol) por su ayuda con la técnica ITC.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

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記事を引用
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

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