概要

治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

Published: May 10, 2022
doi:

概要

等温滴定熱量測定を使用して、ウイルス侵入前後のライフサイクル段階を標的とする抗B型肝炎ウイルス(HBV)化合物をスクリーニングするためのプロトコルを提示し、宿主タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドとの結合親和性(KD)を測定します。抗ウイルス効果は、ウイルスライフサイクルマーカー(cccDNA形成、転写、およびウイルス集合)の抑制によって決定されました。

Abstract

B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、肝細胞癌の重要な危険因子と見なされてきました。現在の治療はウイルス量を減らすことしかできませんが、完全な寛解をもたらすことはできません。HBV感染の効率的な肝細胞モデルは、治療薬のスクリーニングに不可欠な、実物に忠実なウイルスライフサイクルを提供します。利用可能なほとんどの抗HBV剤は、ウイルス侵入後のライフサイクル段階を標的としていますが、ウイルス侵入前は標的としていません。このプロトコルは、前ウイルス侵入およびウイルス侵入後のライフサイクル段階を標的とする治療薬をスクリーニングすることができる有能な肝細胞モデルの生成を詳述する。これには、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)結合、cccDNA形成、転写、および宿主細胞としてのimHCまたはHepaRGに基づくウイルスアセンブリの標的化が含まれます。ここで、HBV侵入阻害アッセイでは、NTCPを介したHBV結合および輸送機能を阻害するためにクルクミンを使用した。阻害剤は、熱力学的パラメーターに基づくHBV薬物スクリーニングのための普遍的なツールである等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、NTCPとの結合親和性(KD)を評価しました。

Introduction

B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、世界中で生命を脅かす病気と見なされています。慢性HBV感染症は、肝硬変と肝細胞癌のリスクを伴います1。現在の抗HBV治療は、主にヌクレオス(t)イド類似体(NA)およびインターフェロンアルファ(IFN-α)2,3を使用したウイルス侵入後に焦点を当てています。HBV侵入阻害剤であるミルクルデックスBの発見により、抗HBV薬の新規標的が特定されました4。慢性HBVにおける侵入阻害剤とNAの組み合わせは、ウイルス複製のみを標的とするウイルス量と比較してウイルス量を大幅に減少させました5,6。しかしながら、HBV侵入阻害剤のスクリーニングのための古典的な肝細胞モデルは、低いウイルス受容体レベル(タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド、NTCP)によって制限される。肝癌細胞(すなわち、HepG2およびHuh7)におけるhNTCPの過剰発現は、HBV感染性を改善する7,8。それにもかかわらず、これらの細胞株は低レベルの第I相および第II相薬物代謝酵素を発現し、遺伝的不安定性を示します9。前ウイルス侵入、NTCP結合、ウイルス侵入など、候補抗HBV化合物の明確なメカニズムを標的とするのに役立つ肝細胞モデルは、効果的な併用レジメンの同定と開発を促進します。クルクミンの抗HBV活性の研究は、ウイルス侵入後の中断に加えて、新しいメカニズムとしてウイルス侵入の抑制を解明しました。このプロトコルは、抗HBV侵入分子10のスクリーニングのための宿主モデルを詳述する。

この方法の目的は、ウイルス侵入阻害、特にNTCP結合および輸送の遮断のための候補となる抗HBV化合物を探索することです。NTCP発現はHBVの侵入と感染にとって重要な要素であるため、NTCPレベルを最大化するために肝細胞成熟プロトコルを最適化しました11。さらに、このプロトコルは、HBV侵入に対する阻害効果を、HBV付着の阻害対内在化の阻害として区別することができる。タウロコール酸(TCA)取り込みアッセイも、NTCP輸送を表すために放射性同位元素の代わりにELISAベースの方法を用いて改変された12,13。受容体とリガンドの相互作用は、それらの3D構造によって確認された14,15。NTCP機能の阻害は、TCA取り込み活性を測定することによって評価することができる16。しかしながら、この技術は、候補阻害剤へのNTCP結合の直接的な証拠を提供しなかった。したがって、結合は、表面プラズモン共鳴17、ELISA、蛍光ベースの熱シフトアッセイ(FTSA)18、FRET19、AlphaScreen、および他の様々な方法20などの様々な技術を用いて調べることができる。これらの手法の中でも、ITCはほぼすべての反応21において熱吸収または発光を観察できるため、結合解析における目標標準である。NTCPと候補化合物の結合親和性(KD)は、ITCを用いて直接評価した。これらの親和性値は、in silico予測モデル22を用いて得られた値よりも正確であった。

このプロトコルは、肝細胞の成熟、HBV感染、およびHBV侵入阻害剤のスクリーニングにおける技術をカバーしています。簡単に説明すると、肝細胞モデルは、imHCおよびHepaRG細胞株に基づいて開発された。培養細胞は2週間以内に成熟肝細胞に分化した。NTCPレベルのアップレギュレーションは、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、およびフローサイトメトリーを使用して検出されました11。B型肝炎ビリオン(HBVcc)が産生され、HepG2.2.15から収集されました。分化したimHCまたはHepaRG(d-imHC、d-HepaRG)を、HBVビリオンの接種2時間前に抗HBV候補で予防的に処理した。実験の期待される結果は、細胞のHBVと感染力を低下させる薬剤の特定でした。抗NTCP活性は、TCA取り込みアッセイを用いて評価した。NTCP活性は、NTCPを特異的に結合した薬剤によって抑制され得る。ITC技術は、生体分子複合体の非共有結合相互作用を介して受容体に対するリガンドの結合親和性(KD)を決定し、阻害剤とその標的タンパク質を予測できる相互作用的結合の実現可能性を調べるために採用されました23,24。例えば、KD ≥ 1 ×10 3 mMは弱い結合を表し、K D ≥ 1 × 106 μMは中程度の結合を表し、KD ≤ 1 × 109 nMは強い結合を表す。ΔGは結合相互作用と直接相関しています。特に、負のΔGとの反応はエクセルゴニック反応であり、結合が自発的なプロセスであることを示す。負のΔHとの反応は、結合プロセスが水素結合とファンデルワールス力に依存することを示します。TCA取り込みとITCデータの両方を使用して、抗HBVエントリーエージェントをスクリーニングすることができます。これらのプロトコルの結果は、抗HBVスクリーニングだけでなく、結合親和性と輸送機能を通じて評価されるNTCPとの相互作用の基礎も提供できます。この論文では、宿主細胞の調製と特性評価、実験デザイン、および抗HBVエントリーの評価とNTCP結合親和性について説明します。

Protocol

注意: 次の手順は、クラスIIの生物学的ハザードフローフードまたは層流フードで実行する必要があります。HBVの取り扱いはIRBによって倫理的に承認されました(MURA2020/1545)。このプロトコルで使用されるすべての溶液、試薬、機器、および細胞株の詳細については、 材料表 を参照してください。 1. 宿主細胞(成熟肝細胞)の調製 肝細胞(3.75 …

Representative Results

特にimHCの分化期(図1A)において、二核細胞および多角形の形態(図1)を含む肝成熟の特徴が観察された。NTCP発現の大幅な増加は、d-HepaRGおよびd-imHCにおいてそれぞれ7倍および40倍で測定された(図1B)。HBV侵入に対する感受性を付与すると仮定された高度にグリコシル化されたNTCPは、d-HepaRGよりもd-imHCでより多く検出されました(<st…

Discussion

HBV感染は、肝細胞上のヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)への低親和性結合25、続いてNTCPへの結合、続いてエンドサイトーシス26によるインターナリゼーションによって開始されます。NTCPはHBV侵入の重要な受容体であるため、HBV侵入を標的とすることは、臨床的には 、de novo 感染、母子感染(MTCT)、および肝移植後の再発を減少させるように翻訳する?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究プロジェクトは、マヒドン大学とタイ科学研究イノベーション(TSRI)の支援を受けており、A. WongkajornsilpとK. Sa-ngiamsuntornに別々に授与されています。この作業は、競争力のためのプログラム管理ユニット(助成金番号C10F630093)を通じて、国立高等教育科学研究イノベーション政策評議会のオフィスによって財政的に支援されました。A. Wongkajornsilpは、マヒドン大学医学部シリラート病院のChalermprakiat助成金の受領者です。著者らは、ITC技術を支援してくれたSawinee Seemakhan嬢(マヒドン大学理学部創薬エクセレントセンター)に感謝の意を表します。

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

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記事を引用
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

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