Un modelo competente de hepatocitos que examina la entrada del virus de la hepatitis B a través del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio como objetivo terapéutico

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se considera una enfermedad potencialmente mortal en todo el mundo. La infección crónica por VHB está cargada de riesgo de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular¹. El tratamiento actual contra el VHB se centra principalmente en la entrada después de la viral utilizando análogos de nucleólidos (NA) e interferón-alfa (IFN-α)^2,3. El descubrimiento de un inhibidor de la entrada del VHB, Myrcludex B, ha identificado un nuevo objetivo para los agentes anti-VHB⁴. La combinación de inhibidores de entrada y NAs en el VHB crónico ha disminuido significativamente la carga viral en comparación con aquellos dirigidos a la replicación viral sola ^5,6. Sin embargo, el modelo clásico de hepatocitos para el cribado de los inhibidores de la entrada al VHB está limitado por los bajos niveles de receptores virales (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, NTCP). La sobreexpresión de hNTCP en células hepatomas (es decir, HepG2 y Huh7) mejora la infectividad del VHB ^7,8. Sin embargo, estas líneas celulares expresan bajos niveles de enzimas metabolizadoras de fármacos de fase I y II y exhiben inestabilidad genética⁹. Los modelos de hepatocitos que pueden ayudar a atacar distintos mecanismos de compuestos candidatos contra el VHB, como la entrada previral, la unión a NTCP y la entrada viral, acelerarían la identificación y el desarrollo de regímenes de combinación eficaces. El estudio de la actividad anti-VHB de la curcumina ha dilucidado la inhibición de la entrada viral como un nuevo mecanismo además de la interrupción posterior a la entrada viral. Este protocolo detalla un modelo de huésped para el cribado de moléculas de entrada anti-VHB¹⁰.

El objetivo de este método es explorar compuestos candidatos anti-VHB para la inhibición de la entrada viral, especialmente bloqueando la unión y el transporte de NTCP. Como la expresión de NTCP es un factor crítico para la entrada e infección del VHB, optimizamos el protocolo de maduración de hepatocitos para maximizar los niveles de NTCP¹¹. Además, este protocolo puede diferenciar el efecto inhibitorio sobre la entrada del VHB como inhibición de la unión al VHB versus inhibición de la internalización. El ensayo de captación de ácido taurocólico (TCA) también se modificó utilizando un método basado en ELISA en lugar de un radioisótopo para representar el transporte NTCP^12,13. La interacción receptor y ligando fue confirmada por sus estructuras 3D^14,15. La inhibición de la función NTCP puede ser evaluada midiendo la actividad de captación de TCA¹⁶. Sin embargo, esta técnica no proporcionó evidencia directa de unión de NTCP a los inhibidores candidatos. Por lo tanto, la unión puede investigarse utilizando diversas técnicas, como la resonancia de plasmones de superficie¹⁷, ELISA, ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia (FTSA)18, FRET ¹⁹, AlphaScreen y varios otros métodos²⁰. Entre estas técnicas, el ITC es un estándar objetivo en el análisis de unión porque puede observar la absorción o emisión de calor en casi todas las reacciones²¹. La afinidad de unión (K_D) de NTCP y compuestos candidatos se evaluó directamente mediante ITC; Esos valores de afinidad fueron más precisos que los obtenidos utilizando el modelo de predicción in silico ²².

Este protocolo cubre técnicas de maduración de hepatocitos, infección por VHB y detección de inhibidores de la entrada de VHB. Brevemente, se desarrolló un modelo de hepatocitos basado en líneas celulares imHC y HepaRG. Las células cultivadas se diferenciaron en hepatocitos maduros en 2 semanas. La regulación positiva de los niveles de NTCP se detectó mediante PCR en tiempo real, western blot y citometría de flujo¹¹. El virión de la hepatitis B (VHBcc) se produjo y recolectó de HepG2.2.15. El imHC o HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) fue tratado profilácticamente con los candidatos anti-VHB 2 h antes de la inoculación con virión VHB. El resultado esperado del experimento fue la identificación de los agentes que disminuyen el VHB celular y la infectividad. La actividad anti-NTCP se evaluó mediante el ensayo de captación de TCA. La actividad de NTCP podría ser suprimida por los agentes que se unieron específicamente a NTCP. La técnica ITC fue empleada para investigar la factibilidad de la unión interactiva que podría predecir inhibidores y sus proteínas diana, determinando la afinidad de unión (K_D) del ligando para el receptor a través de interacciones no covalentes del complejo biomolecular^23,24. Por ejemplo, K D ≥ 1 × 10³ mM representa una unión débil, K D ≥ 1 × 10⁶ μM representa una unión moderada y K _D ≤ 1 × 10⁹ nM representa una unión fuerte. El ΔG está directamente correlacionado con las interacciones de unión. En particular, una reacción con ΔG negativo es una reacción exergónica, lo que indica que la unión es un proceso espontáneo. Una reacción con un ΔH negativo indica que los procesos de unión dependen del enlace de hidrógeno y de las fuerzas de Van der Waals. Tanto la captación de TCA como los datos del ITC podrían utilizarse para detectar agentes de entrada anti-VHB. Los resultados de estos protocolos pueden proporcionar una base no solo para la detección contra el VHB, sino también para la interacción con NTCP evaluada a través de la afinidad vinculante y la función de transporte. Este documento describe la preparación y caracterización de la célula huésped, el diseño experimental y la evaluación de la entrada anti-VHB junto con la afinidad de unión a NTCP.