Standart işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) tekniklerini kullandık ve bunları işitsel işlev için erken bir kuş modeli olan yavru tavuklara uyguladık. Protokol, hayvan hazırlama ve ABR edinme tekniklerini, diğer kuş veya kemirgen modellerine çevrilebilecek adımlarla ayrıntılı olarak özetlemektedir.
İşitsel beyin sapı yanıtı (ABR), klinik odyolojide, insan dışı hayvanlarda ve insan araştırmalarında paha biçilmez bir testtir. İşitsel nöral senkronizasyonu ölçmede ve diğer omurgalı model sistemlerinde işitme duyarlılığını tahmin etmede ABR’lerin yaygın olarak kullanılmasına rağmen, tavuktaki ABR’leri kaydetme yöntemleri yaklaşık kırk yıldır bildirilmemiştir. Tavuklar sağlam bir hayvan araştırma modeli sağlar, çünkü işitsel sistemleri geç embriyonik ve erken kuluçka aşamalarında fonksiyonel olgunlaşmaya yakındır. Tavuk yavrularında subdermal iğne elektrot dizileri kullanarak bir veya iki kanallı ABR kayıtlarını ortaya çıkarmak için kullanılan yöntemleri gösterdik. Elektrot kayıt konfigürasyonundan (yani montajdan) bağımsız olarak, ABR kayıtları, bir eşik üstü tıklama uyaranının ilk 6 ms’sinde 3-4 pozitif giden tepe dalga formu içeriyordu. Tepeden oluğa dalga formu genlikleri, yüksek yoğunluklu seviyelerde 2-11 μV arasında değişmekte olup, beklenen gecikme yoğunluğu fonksiyonlarını sergileyen pozitif pikler (yani, azalan yoğunluğun bir fonksiyonu olarak gecikme süresinde artış). Standartlaştırılmış kulaklık pozisyonu, gevşek cilt kulak kanalını tıkayabileceğinden ve hayvan hareketi uyaran dönüştürücüsünü yerinden çıkarabileceğinden, optimum kayıtlar için kritik öneme sahipti. Tepe genlikleri daha küçüktü ve hayvan vücut ısısı düştükçe gecikmeler daha uzundu ve fizyolojik vücut ısısını koruma ihtiyacını destekledi. Genç yavrular için (<3 saat kuluçka sonrası gün 1), eşikler ~5 dB yükseltildi, pik gecikme süreleri ~ 1-2 ms arttı ve zirveden oluğa genlikler yaşlı yavrulara kıyasla ~ 1 μV azaldı. Bu, potansiyel bir iletken ilgili sorunu (yani, orta kulak boşluğundaki sıvı) düşündürmektedir ve genç yavrular için dikkate alınmalıdır. Genel olarak, burada özetlenen ABR yöntemleri, tavuk yavrularında gelişimin farklı aşamalarına uygulanabilecek in-vivo işitsel fonksiyonun doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde kaydedilmesine izin verir. Bu bulgular, işitme kaybı, yaşlanma veya diğer işitsel ile ilgili manipülasyonların insan ve memeli modelleriyle kolayca karşılaştırılabilir.
Ses uyaranlarına karşı uyarılmış nöral tepkilerin incelenmesi yarım yüzyıldan daha eskiye dayanmaktadır1. İşitsel beyin sapı yanıtı (ABR), hem insan olmayan hayvanlarda hem de insanlarda on yıllardır işitsel fonksiyonun bir ölçüsü olarak kullanılan uyarılmış bir potansiyeldir. İnsan ABR’si, geleneksel olarak Roma rakamları (I-VII) ile etiketlenmiş beş ila yedi dalga formu zirvesi sunar2. Bu zirveler, nöral yanıtların gecikme sürelerine (milisaniye cinsinden oluşum süresi) ve genliklerine (mikrovoltlarda tepeden oluğa boyut) göre analiz edilir. ABR, işitme sinirinin fonksiyonunu ve bütünlüğünü, beyin sapı ve işitme eşiği duyarlılığını değerlendirmede etkilidir. İşitsel sistemdeki eksiklikler yok, azalmış, uzamış veya anormal ABR gecikmeleri ve genlikleri ile sonuçlanır. Dikkat çekici bir şekilde, bu parametreler insanlarda ve diğer hayvanlarda neredeyse aynıdır, bu da onu omurgalı modelleri arasında işitsel fonksiyonun tutarlı bir objektif testi haline getirir3.
Böyle bir model sistemi tavuktur ve çeşitli nedenlerden dolayı özellikle yararlıdır. Kuşlar altrisiyel veya precocial4 olarak sınıflandırılabilir. Altrisiyel kuşlar hala gelişmekte olan duyularla yumurtadan çıkarlar; Örneğin, peçeli baykuşlar, kapak5’ten dört gün sonrasına kadar tutarlı bir ABR göstermez. Tavuk gibi erken hayvanlar, neredeyse olgun duyulara sahip yumurtadan çıkar. İşitmenin başlangıcı embriyonik gelişimde meydana gelir, öyle ki yumurtadan çıkmadan günler önce (embriyonik gün 21), işitsel sistem fonksiyonel olgunlaşmaya yakındır 6,7,8. Altrisiyel kuşlar ve çoğu memeli modeli, gelişimi etkileyen ve işitme olgunlaşana kadar hayvancılık gerektiren dışsal faktörlere karşı hassastır. Tavuk ABR’leri, kapakla aynı gün, beslenme veya zenginleştirilmiş bir ortam ihtiyacından vazgeçerek gerçekleştirilebilir.
Embriyonik tavuk, özellikle işitsel beyin sapında, fizyoloji ve gelişim için iyi çalışılmış bir model olmuştur. Spesifik yapılar, çekirdek magnocellularis (NM) ve nucleus angularis (NA) olarak bölünmüş tavuk koklear çekirdeğini ve nucleus laminaris (NL) olarak bilinen medial superior zeytinin kuş korelasyonunu içerir6,7. ABR, ön beyin ve korteks seviyesinden önce merkezi işitsel fonksiyona odaklanmak için idealdir. İn-vivo ABR ölçümleri ile gelişim8, fizyoloji9, tonotopi 10 ve genetik11,12’nin in-vitro nöronal çalışmaları arasındaki çeviri, genel işitsel fonksiyon çalışmalarını destekleyen ideal araştırma fırsatları sunmaktadır.
ABR, memeli modellerinde kapsamlı bir şekilde çalışılmasına rağmen, kuşlar için daha az odak noktası olmuştur. Önceki kuş ABR çalışmaları, muhabbet kuşu 13, ağaçkakan14, martı15, dalış kuşları 16, zebra ispinozu 17, günlük raptors 18, kanarya 19, üç baykuş türü5,20,21,22 ve tavuk 23’ün karakterizasyonlarını içerir. Tavuk ABR’sinin son kapsamlı karakterizasyonundan bu yana geçen yaklaşık kırk yıl göz önüne alındığında, daha önce kullanılan ekipman ve tekniklerin çoğu değişmiştir. Diğer kuş modellerindeki çalışmalardan elde edilen bilgiler, modern tavuk ABR metodolojisinin geliştirilmesine yardımcı olurken, aynı zamanda tavuk ABR ile bir karşılaştırma görevi de görebilir. Bu makale, embriyonik gelişim aşamalarına ve diğer küçük kemirgen ve kuş modellerine de uygulanabilecek yavru tavuklarda ABR kaydına izin vermek için deneysel kurulum ve tasarımı özetleyecektir. Ek olarak, tavuğun erken gelişimi göz önüne alındığında, gelişimsel manipülasyonlar kapsamlı bir hayvancılık olmadan gerçekleştirilebilir. Gelişmekte olan bir embriyoya yapılan manipülasyonlar, hayvanın neredeyse olgun işitme yetenekleriyle yumurtadan çıkmasından sadece birkaç saat sonra değerlendirilebilir.
Kuşların işitsel beyin sapı iyi çalışılmıştır ve birçok yapı memeli işitsel yoluna benzer. İşitme siniri, iki birinci dereceden merkezi çekirdeğe, koklear çekirdek magnoselülaris (NM) ve açısal (NA) üzerine uyarıcı girdiler sağlar. NM, işitsel hedefi olan nucleus laminaris’e (NL)7 iki taraflı olarak uyarıcı bir projeksiyon gönderir. NL nükleus mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41’e yansıtır. NL ayrıca NM, NA ve NL42’ye geri besleme inhibisyonu sağlayan üstün olivary çekirdeğine (SON) de yansıtılır. Bu alt işitsel beyin sapı mikrodevresi, hizmet ettiği işlev, ses lokalizasyonu ve binaural işitme33 için zarif bir şekilde korunmuştur. Kuşun üst işitsel beyin sapı bölgeleri ayrıca memeli lateral lemniscusuna ve orta beyindeki inferior kollikulusa benzer çekirdeklere sahiptir. Bu benzerlikler göz önüne alındığında, kuş ABR’sinin işitsel orta beyine kadar olan bileşimi tüm omurgalılar arasında karşılaştırılabilir.
Birden fazla kuş türü, uyaran başlangıcını takiben 6 ms içinde üç pozitif tepe noktası gösterirken, ABR zirvelerinin merkezi işitsel yapılarla korelasyonu bazı değişkenliklere sahiptir. Dalga I’in periferik baziler papilla ve işitme sinirinden gelen ilk nöral yanıt olduğu ve bireyler arasında çok az değişkenlik gösterdiği makul olarak varsayılabilir (Şekil 1C). Sonraki Dalga tanımlaması daha az kesindir ve türler arasında farklılık gösterebilir. Kuokkanen ve ark.17 yakın zamanda peçeli baykuşun ABR’sinin Dalga III’ünün NL tarafından üretildiğini belirledi; Bu nedenle, Dalga II’nin koklear çekirdek20’nin NM ve NA’sından kaynaklandığını iddia etmek mantıklıdır. Bununla birlikte, baykuş Dalgası III, uyaran başlangıcından 3 ms sonra üretilen pozitif tepe noktası olarak tanımlandı. Bu, yavru tavuk ABR’sinde tanımlandığı gibi Wave II’ye karşılık gelir. Peçeli baykuş ABR’de dalgalar I ve II birleştirildi.
Yavru tavuk genellikle 6 ms içinde üç tepe noktası ile sunulurken, zaman zaman dördüncü bir tepe noktası gözlenmiştir (örneğin, bkz. Şekil 1A). Dördüncü bir dalgayı ve bazı durumlarda beş dalgalı bir tavuk ABR’sini desteklemek için popülasyon verilerine, daha büyük örneklem büyüklüğüne ve ek deneysel paradigmalara ihtiyaç duyulacaktır. En tutarlı bulgu, burada gösterilen üç tepe temsiliydi.
ABR, nöral senkronizasyonun bir ölçüsü olarak tanımlandığından, işitsel yolaktaki ana çekirdekler, ABR’deki her pozitif giden zirveyi temsil edebilir. İşitme sinirinden NM/NA’ya ve daha sonra NL’ye geçen sinyal, kuluçkalık tavuk ABR’sinde sırasıyla I, II ve III Dalgalarını tanımlayabilir. Ek olarak, tavuk ABR’sinin daha sonra meydana gelen dördüncü zirvesi, üst beyin sapı veya orta beyin işitsel yapısını temsil edebilir. Kuş ABR’lerinin karakterizasyonu, precocial ve altricial kuşlar arasındaki farkı da göz önünde bulundurmalıdır. İşitsel tepkilerin olgunlaşması türler arasında değişecektir ve ayrıca avcı davranışı ve / veya vokal öğrenme gibi diğer kritik özelliklerden de etkilenir4. Ne olursa olsun, tarif edilen yöntem ve teknikler çeşitli kuş ve omurgalı türlerine kolayca uygulanır.
Hayvan vücut ısısının korunmasının önemi Şekil 2’de gösterilmiştir. İç vücut ısısı düştükçe, ABR yanıtlarının gecikmesi aynı uyaran yoğunluğu seviyesi için artmıştır. Bu, vücut ısısı 32 ° C 36,37’nin altına düştüğünde daha belirgindir. ABR’deki kabaca 1 ms gecikme süresi artışı, tavuk23’te daha önce bildirilenden daha azdır. Bununla birlikte, Katayama23, soğutulan ve daha sonra 4 saatlik bir süre boyunca ısıtılan 12 günlük bir yavru kullandı. Şekil 2’deki veriler, soğutma işlemi sırasında 20 dakikalık bir süre boyunca kaydedilmiştir. En kaliteli ve en tutarlı kayıtları elde etmek için, hayvanın vücut ısısı korunmalı ve tüm kayıtlar hayvanlar arasında aynı fizyolojik sıcaklıkta yapılmalıdır.
Yaşın ABR üzerindeki etkisi hafiftir, ancak dikkate alınması önemlidir. ABR’nin sadece Dalga I ve II’sinin gecikmesi önemli ölçüde farklı olsa da, bunun nedeni kısmen Şekil 3’te sadece üç genç yavrunun kullanılmasıdır; diğer üçü tanımlanabilir üç ABR zirvesi ile mevcut değildi. ABR genliği ve eşik kaymaları, büyük örneklem boyutları kullanıldığında veya frekansa özgü ABR’lerin karşılaştırılmasında da belirgin olabilir. Yaşa bağlı bu etki, tavuğun orta kulağındaki sıvıdan kaynaklanabilir. Bu tür iletken değişiklikler, hem insan hem de diğer memeli modelleri için ABR eşiklerinde belirgin bir artışa yol açmaktadır38,39.
İki farklı kayıt montajı kullanılarak benzer tepkiler gözlenmiştir (Şekil 4A). En yaygın montaj, referans elektrodu uyaran alan kulağın arkasına yerleştirirken, referans elektrodunun boyun dokusunda olması, ABR’ye eşlik eden cerrahi müdahale varsa yararlı olabilir. Bununla birlikte, iki kanallı ABR kayıtları kullanılıyorsa, referans elektrotları ayrı ayrı ve simetrik olarak yerleştirilmelidir, bu da referans elektrodunu boyuna yerleştirirse zordur. Referans elektrodunun mastoid konumunun, kaydın mümkün olduğunca çok yönünü standartlaştırması önerilir. İki kanallı ABR kaydı, çok az ekstra hazırlık gerektiren etkili bir araçtır ve kulaklar arasında benzer tepkilerle sonuçlanır. Küçük genlik farklılıkları muhtemelen kulaklığın konumlandırılmasından kaynaklanıyordu. İki kanallı kayıt, deneysel olarak manipüle edilmiş bir kulak veya beyin yarımküresi ile bir kontrol arasında kolay karşılaştırma yapılmasını sağlar. Bu kurulum aynı zamanda binoral ABR’leri test etmek için de gerekli olacaktır. Tavuk ABR’sini kullanan gelecekteki deneyler, kayıt konfigürasyonları ve montajları34 ile ilgili önceki literatüre atıfta bulunabilir.
Bu metodoloji birkaç sınırlama ile birlikte gelir. Adım 5.1’de belirtildiği gibi, zayıf spekulum yerleşimi yanıt olarak 40 dBSPL kaymasına neden olabilir. Bu, manipüle edilmiş veya değiştirilmiş bir hayvanın yanlış yorumlanmasına neden olabilir. Aşağıdaki önlemler önerilir: manipüle edilmiş veya mutant modellerin ABR’lerini almadan önce büyük bir kontrol verisi örneği edinin. Kayıtlar arasında uyaran yoğunluğunu 20 dBSPL’den fazla azaltmayın. Genlik veya gecikme beklenenden daha fazla değişirse, hayvan ve spekulum pozisyonunu kontrol edin. Değişiklikleri gözlemlemek için ABR uyaranını tekrarlayın. Spekulum hareket etmişse, önceki testleri yeniden edinin. Diğer bir sınırlama ABR’lerin kalibrasyonudur. Ses basıncı seviyesini kaydetmek için uygun kalibrasyon olmadan, hayvana sunulan yoğunluk bilinmemektedir. Ses çıkışını ölçerken, deneysel kayıtta olduğu gibi aynı spekulumu ve hayvanın kulak kanalı uzunluğuna (~ 5 mm) yaklaşan bir boşluğun içinde küçük bir mikrofon kullanın. Kalibrasyonlar frekansa özgü olduğu için deneylerde kullanılan aynı ton frekanslarını ölçün. Hem donanım hem de yazılım sistemleri için kılavuz, kalibrasyon için talimatlarla birlikte gelebilir. Ayrıca, tıklama ve ton patlaması ABR’lerini43’ü iyileştirebilen doğrusal faz ve minimum faz filtreleri gibi ek filtreler de vardır. Bu filtreler bu çalışmada kullanılmamıştır. Bir ton patlaması spektral zarfının yükselme ve düşme süresinin, frekansın bir fonksiyonu olarak değişmesi veya tıklama uyaranlarının yükselme ve düşme zamanının değişmesi gibi ek hususlar da incelenmemiştir. Bunlar, güvenilir ve tutarlı ABR’ler elde edilebildiğinde gelecekteki iyi araştırmalardır.
Yavru tavuğun diğer kuş modelleriyle karşılaştırılması umut vericidir. Muhabbet kuşları ve doğu çığlık baykuşları da ABR 13,22’nin ilk 6 ms’sinde üç pozitif mikrovolt zirvesi gösterir. Farklı ağaçkakan türlerinde, üç tepe noktası da görülür, ancak gecikmeleri daha sonra zamandır. Ek olarak, ağaçkakanlardaki en iyi frekans duyarlılığı aralığı 1500 ila 4000 Hz arasındadır, bu da tavuğun 1000 Hz’deki en iyi eşiğinden biraz daha yüksektir. Yetişkin tavukta, en iyi hassasiyet 2000 Hz35’tir, bu nedenle tavuk yavruları yetişkinlere dönüştükçe yüksek frekansların duyulması daha iyi olabilir. Bu gelişme, hayvanın altrisiyal veya erken gelişimini dikkate alarak kuş türleri arasında farklılık gösterecektir4.
Burada özetlenen deneysel yöntemler, hangi faktörlerin işitsel yanıtlarda ve eşiklerde ve ayrıca embriyonik gelişimin farklı aşamalarındaki çalışmalarda zararlara veya değişikliklere yol açtığını belirlemeye yardımcı olabilir. Genetik manipülasyon, yaşlanma ve gürültüye maruz kalma, hayvanlarda ve diğer kuş modellerinde bilinen manipülasyonlardır24,25,44,45. Bu yöntemler, in-ovo elektroporasyonu gibi tekniklerin, işitsel beyin sapının bir tarafında fokal ve geçici olarak kontrol edilen proteinlerin ekspresyonuna izin verdiği için tavuk modeline genişletilmelidir12,46. Bu, ABR’lerin genetik olarak manipüle edilmiş kulaktan kontralateral kontrol kulağına iki kanallı bir kayıt paradigması kullanılarak doğrudan karşılaştırılmasına izin verir.
Genel olarak, yavru tavukların ABR’si, insan ve diğer memeli modellerinde işitme fonksiyonu ölçümleriyle neredeyse aynı olan yararlı bir araştırma yöntemidir. Aynı zamanda invaziv olmayan, in-vivo bir metodolojidir. Anestezik enjeksiyon ve birkaç milimetrelik subdermal elektrot yerleştirilmesi dışında, başka hiçbir fiziksel manipülasyona gerek yoktur. Bir yavru, uygun bir ortamda tutulursa, teorik olarak günler veya haftalar süren gelişimsel bir zaman dilimi boyunca birçok kez test edilebilir. Bu protokol sadece yavru tavuk ABR’si için gerekli adımları ve kayıt parametrelerini ortaya koymakla kalmaz, aynı zamanda işitsel beyin sapı fonksiyonuna daha fazla test yapılmasını sağlayabilecek bir kuş ABR’sinin özelliklerini de önerir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH/NIDCD R01 DC017167 tarafından desteklenmektedir
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |