Hemos utilizado técnicas estándar de respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) y las hemos aplicado a pollos lactantes, un modelo aviar precoz para la función auditiva. El protocolo describe en detalle las técnicas de preparación animal y adquisición de ABR, con pasos que podrían traducirse a otros modelos de aves o roedores.
La respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) es un ensayo invaluable en audiología clínica, animales no humanos e investigación humana. A pesar del uso generalizado de ABRs en la medición de la sincronía neuronal auditiva y la estimación de la sensibilidad auditiva en otros sistemas modelo de vertebrados, los métodos para registrar ABRs en el pollo no se han reportado en casi cuatro décadas. Los pollos proporcionan un modelo robusto de investigación en animales porque su sistema auditivo está cerca de la maduración funcional durante las etapas embrionarias tardías y tempranas de la cría. Hemos demostrado métodos utilizados para obtener registros ABR de uno o dos canales utilizando matrices de electrodos de aguja subdérmica en crías de pollo. Independientemente de la configuración de grabación de electrodos (es decir, el montaje), las grabaciones ABR incluyeron 3-4 formas de onda de pico positivas dentro de los primeros 6 ms de un estímulo de clic supratenso. Las amplitudes de la forma de onda de pico a valle oscilaron entre 2 y 11 μV a niveles de alta intensidad, con picos positivos que exhibieron funciones de intensidad de latencia esperadas (es decir, aumento de la latencia en función de la disminución de la intensidad). La posición estandarizada de los auriculares fue fundamental para las grabaciones óptimas, ya que la piel suelta puede ocluir el canal auditivo y el movimiento de los animales puede desalojar el transductor de estímulo. Las amplitudes máximas fueron más pequeñas y las latencias fueron más largas a medida que la temperatura corporal de los animales disminuyó, lo que respalda la necesidad de mantener la temperatura corporal fisiológica. Para las crías jóvenes (<3 h después del día 1 de la eclosión), los umbrales se elevaron en ~ 5 dB, las latencias máximas aumentaron ~ 1-2 ms y las amplitudes de pico a valle disminuyeron ~ 1 μV en comparación con las crías más viejas. Esto sugiere un posible problema relacionado con el conductivo (es decir, líquido en la cavidad del oído medio) y debe considerarse para las crías jóvenes. En general, los métodos ABR descritos aquí permiten un registro preciso y reproducible de la función auditiva in vivo en crías de pollo que podría aplicarse a diferentes etapas de desarrollo. Tales hallazgos se comparan fácilmente con modelos humanos y mamíferos de pérdida auditiva, envejecimiento u otras manipulaciones relacionadas con la audición.
El estudio de las respuestas neuronales evocadas a los estímulos sonoros se remonta a más de medio siglo1. La respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) es un potencial evocado que se ha utilizado como una medida de la función auditiva tanto en animales no humanos como en humanos durante décadas. El ABR humano presenta de cinco a siete picos de forma de onda etiquetados convencionalmente por números romanos (I-VII)2. Estos picos se analizan en función de su latencia (tiempo de ocurrencia en milisegundos) y amplitud (tamaño de pico a valle en microvoltios) de las respuestas neuronales. El ABR es fundamental para evaluar la función y la integridad del nervio auditivo, así como la sensibilidad del tronco encefálico y del umbral auditivo. Los déficits en el sistema auditivo resultan en latencias y amplitudes ABR ausentes, reducidas, prolongadas o anormales. Sorprendentemente, estos parámetros son casi idénticos en humanos y otros animales, lo que lo convierte en una prueba objetiva consistente de la función auditiva en todos los modelos de vertebrados3.
Uno de estos sistemas modelo es el pollo, y es especialmente útil por una variedad de razones. Las aves se pueden clasificar como altriciales o precociales4. Las aves altriciales eclosionan con los sentidos aún en desarrollo; por ejemplo, las lechuzas no muestran un ABR consistente hasta cuatro días después de la eclosión5. Animales precoces como el pollo eclosionan con sentidos casi maduros. El inicio de la audición se produce en el desarrollo embrionario, de tal manera que días antes de la eclosión (día embrionario 21), el sistema auditivo está cerca de la maduración funcional 6,7,8. Las aves altriciales y la mayoría de los modelos de mamíferos son susceptibles a factores extrínsecos que influyen en el desarrollo y requieren la cría de animales hasta que la audición esté madura. Los ABR de pollo se pueden realizar el mismo día de la eclosión, renunciando a la necesidad de alimentación o a un ambiente enriquecido.
El pollo embrionario ha sido un modelo bien estudiado para la fisiología y el desarrollo, especialmente en el tronco encefálico auditivo. Las estructuras específicas incluyen el núcleo coclear del pollo, dividido en núcleo magnocellularis (NM) y núcleo angularis (NA), y el correlato aviar de la aceituna superior medial conocido como núcleo laminaris (NL)6,7. El ABR es ideal para centrarse en la función auditiva central antes del nivel del cerebro anterior y la corteza. La traducción entre las mediciones de ABR in vivo y los estudios neuronales in vitro del desarrollo8, fisiología9, tonotopía10 y genética11,12 proporciona oportunidades de investigación ideales que respaldan los estudios de la función auditiva general.
Aunque el ABR ha sido ampliamente estudiado en modelos de mamíferos, ha habido menos enfoque para las aves. Los estudios previos de ABR aviar incluyen caracterizaciones del periquito13, pájaro carpintero 14, gaviota15, aves buceadoras16, pinzón cebra17, rapaces diurnas18, canario19, tres especies de búho 5,20,21,22 y pollo23. Dadas las casi cuatro décadas transcurridas desde la última caracterización exhaustiva del pollo ABR, muchos de los equipos y técnicas utilizados anteriormente han cambiado. Los conocimientos de estudios en otros modelos aviares pueden ayudar a desarrollar la metodología MODERNA de ABR de pollo al tiempo que sirven como una comparación con el ABR de pollo. Este documento describirá la configuración y el diseño experimentales para permitir el registro de ABR en pollos recién nacidos que también podría aplicarse a las etapas embrionarias de desarrollo y otros modelos de roedores pequeños y aves. Además, dado el desarrollo precoz del pollo, las manipulaciones del desarrollo se pueden realizar sin ninguna cría extensa de animales. Las manipulaciones a un embrión en desarrollo se pueden evaluar solo unas pocas horas después de que el animal eclosiona con capacidades auditivas casi maduras.
El tronco encefálico auditivo de las aves está bien estudiado, y muchas estructuras son análogas a la vía auditiva de los mamíferos. El nervio auditivo proporciona entradas excitatorias sobre los dos núcleos centrales de primer orden, el núcleo coclear magnocellularis (NM) y el angularis (NA). Nm envía una proyección excitatoria bilateralmente a su diana auditiva, el núcleo laminaris (NL)7. NL se proyecta al núcleo mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. NL también se proyecta al núcleo olivar superior (SON), que proporciona inhibición de retroalimentación a NM, NA y NL42. Este microcircuito auditivo inferior del tronco encefálico se conserva exquisitamente para la función que cumple, la localización del sonido y la audición binaural33. Las regiones auditivas superiores del tronco encefálico del ave también tienen núcleos análogos al lemnisco lateral de los mamíferos y al colículo inferior en el mesencéfalo. Dadas estas similitudes, la composición del ABR aviar hasta el mesencéfalo auditivo es comparable en todos los vertebrados.
Mientras que múltiples especies de aves muestran tres picos positivos dentro de los 6 ms posteriores al inicio del estímulo, la correlación de los picos abr con las estructuras auditivas centrales tiene cierta variabilidad. Se puede suponer razonablemente que la onda I es la primera respuesta neuronal de la papila basilar periférica y el nervio auditivo y muestra poca variabilidad entre los individuos (Figura 1C). La identificación posterior de la onda es menos segura y puede diferir entre las especies. Kuokkanen et al.17 determinaron recientemente que la Onda III del ABR de la lechuza común es generada por NL; por lo tanto, es razonable argumentar que la Onda II se origina a partir de NM y NA del núcleo coclear20. Sin embargo, el búho Wave III se definió como el pico positivo generado 3 ms después del inicio del estímulo. Esto corresponde a la Onda II tal como se define en el pollo de cría ABR. En la lechuza común ABR, se combinaron las olas I y II.
Mientras que el pollo recién nacido generalmente presentaba tres picos dentro de los 6 ms, ocasionalmente se observó un cuarto pico (por ejemplo, ver Figura 1A). Se necesitarían datos de población, un mayor tamaño de muestra y paradigmas experimentales adicionales para apoyar una cuarta ola y, en algunos casos, un ABR de pollo de cinco olas. El hallazgo más consistente fueron las tres representaciones máximas que se muestran aquí.
Dado que el ABR se define como una medida de la sincronía neuronal, los núcleos principales en la vía auditiva podrían representar cada pico positivo en el ABR. La señal que pasa del nervio auditivo a NM/NA y luego a NL puede definir las ondas I, II y III en el pollo varón varón, respectivamente. Además, el cuarto pico posterior del ABR del pollo podría representar una estructura auditiva superior del tronco encefálico o del mesencéfalo. La caracterización de los ABR aviares también debe considerar la diferencia entre aves precociales y altriciales. La maduración de las respuestas auditivas variará entre especies y también se ve afectada por otros rasgos críticos como el comportamiento de los depredadores y / o el aprendizaje vocal4. En cualquier caso, los métodos y técnicas descritos se aplican fácilmente a una variedad de especies de aves y vertebrados.
La importancia de mantener la temperatura corporal animal se ilustra en la Figura 2. A medida que la temperatura interna del cuerpo disminuyó, la latencia de las respuestas ABR aumentó para el mismo nivel de intensidad del estímulo. Esto es más pronunciado cuando la temperatura corporal desciende por debajo de 32 °C36,37. El aumento de latencia de aproximadamente 1 ms en el ABR es menor que el reportado anteriormente en el pollo23. Sin embargo, Katayama23 utilizó una cría de 12 días de edad que se enfrió y posteriormente se calentó durante un período de 4 h. Los datos de la Figura 2 se registraron durante el proceso de enfriamiento durante un período de 20 minutos. Para adquirir la mejor calidad y los registros más consistentes, se debe mantener la temperatura corporal del animal, y todos los registros deben hacerse a la misma temperatura fisiológica entre los animales.
El efecto de la edad en el ABR es leve pero importante de considerar. Si bien solo la latencia de las Ondas I y II del ABR fue significativamente diferente, esto se debe en parte a que solo se usaron tres crías jóvenes en la Figura 3; los otros tres no presentaron tres picos ABR identificables. La amplitud de ABR y los cambios de umbral también pueden ser evidentes si se utilizan tamaños de muestra grandes o se comparan ABR específicos de frecuencia. Este efecto relacionado con la edad podría ser causado por el líquido en el oído medio del pollo. Tales cambios conductores conducen a un marcado aumento de los umbrales de ABR tanto para modelos humanos como para otros mamíferos38,39.
Utilizando dos montajes de grabación diferentes, se observaron respuestas similares (Figura 4A). Si bien el montaje más común coloca el electrodo de referencia detrás de la oreja receptora del estímulo, tener el electrodo de referencia en el tejido del cuello puede ser útil si hay una intervención quirúrgica que acompaña al ABR. Sin embargo, si se utilizan grabaciones ABR de dos canales, los electrodos de referencia deben colocarse por separado y simétricamente, lo que es difícil si se coloca el electrodo de referencia en el cuello. Se recomienda la posición mastoidea para el electrodo de referencia para estandarizar tantos aspectos de la grabación como sea posible. La grabación ABR de dos canales es una herramienta efectiva que requiere poca preparación adicional y da como resultado respuestas similares entre los oídos. Las diferencias de amplitud menores probablemente se debieron a la posición del auricular. La grabación de dos canales permite una fácil comparación entre un oído manipulado experimentalmente o un hemisferio cerebral versus un control. Esta configuración también sería necesaria para probar los ABR binaurales. Los experimentos futuros con el pollo ABR pueden referirse a la literatura previa sobre configuraciones y montajes de grabación34.
Esta metodología viene con varias limitaciones. Como se mencionó en el paso 5.1, la mala colocación del espéculo puede conducir a un cambio de 40 dBSPL en la respuesta. Esto podría causar una interpretación incorrecta de un animal manipulado o modificado. Se recomiendan las siguientes precauciones: adquirir una gran muestra de datos de control antes de adquirir los ABRs de modelos manipulados o mutantes. No disminuya la intensidad del estímulo en más de 20 dBSPL entre grabaciones. Si la amplitud o latencia cambia más de lo esperado, verifique la posición del animal y el espéculo. Repita ese estímulo ABR para observar los cambios. Si el espéculo se ha movido, vuelva a adquirir pruebas previas. Otra limitación es la calibración de los ABR. Sin la calibración adecuada para registrar el nivel de presión sonora, se desconoce la intensidad presentada al animal. Al medir la salida de sonido, use el mismo espéculo que en la grabación experimental y un pequeño micrófono dentro de una cavidad que se aproxime a la longitud del canal auditivo del animal (~ 5 mm). Mida las mismas frecuencias de tono utilizadas en los experimentos, ya que las calibraciones son específicas de la frecuencia. El manual para sistemas de hardware y software puede venir con instrucciones para la calibración. También hay filtros adicionales, como los filtros de fase lineal y de fase mínima, que pueden mejorar los ABR43 de ráfaga de clic y tono. Estos filtros no se utilizaron en el presente estudio. Tampoco se examinaron consideraciones adicionales, como el tiempo de subida y bajada de una envolvente espectral de estallido de tono que cambia en función de la frecuencia o el cambio del tiempo de subida y bajada de los estímulos de clic. Estas son buenas investigaciones futuras una vez que se puedan adquirir ABR confiables y consistentes.
La comparación del pollo recién nacido con otros modelos de aves es prometedora. Los periquitos y los búhos chillones orientales también muestran tres picos positivos de microvoltios dentro de los primeros 6 ms del ABR13,22. En diferentes especies de pájaros carpinteros, también se ven tres picos, pero su latencia es más tardía en el tiempo. Además, el rango de mejor sensibilidad de frecuencia en pájaros carpinteros está entre 1500 y 4000 Hz, que es algo más alto que el mejor umbral del pollo a 1000 Hz. En el pollo adulto, la mejor sensibilidad es a 2000 Hz35, por lo que puede haber una mejor audición de las frecuencias altas a medida que las crías de pollo se convierten en adultos. Ese desarrollo diferirá entre las especies de aves, teniendo en cuenta el desarrollo altricial o precoz del animal4.
Los métodos experimentales descritos aquí pueden ayudar a determinar qué factores conducen a detrimentos o cambios en las respuestas auditivas y los umbrales, así como estudios en diferentes etapas del desarrollo embrionario. La manipulación genética, el envejecimiento y la exposición al ruido son manipulaciones conocidas en animales y otros modelos aviares 24,25,44,45. Estos métodos deberían extenderse al modelo de pollo ahora que técnicas como la electroporación in-ovo permiten la expresión de proteínas que se controlan focal y temporalmente en un lado del tronco encefálico auditivo12,46. Esto permite la comparación directa de los ABR desde el oído manipulado genéticamente con el oído de control contralateral utilizando un paradigma de grabación de dos canales.
En general, el ABR de los pollos recién nacidos es un método de investigación útil, casi idéntico a las medidas de la función auditiva en modelos humanos y otros mamíferos. También es una metodología no invasiva, in vivo . Aparte de la inyección anestésica y la colocación de electrodos subdérmicos de unos pocos milímetros, no se requiere ninguna otra manipulación física. En teoría, una cría podría ser probada varias veces durante un curso de tiempo de desarrollo de días o semanas si se mantiene en un entorno apropiado. Este protocolo no solo establece los pasos necesarios y los parámetros de registro para el POLLO recién nacido ABR, sino que propone características de un ABR aviar que puede informar más pruebas sobre la función auditiva del tronco encefálico.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado por el NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |