We hebben standaard auditieve hersenstamrespons (ABR) technieken gebruikt en toegepast op broedkippen, een vroegrijp vogelmodel voor auditieve functie. Het protocol schetst diervoorbereidings- en ABR-acquisitietechnieken in detail, met stappen die zich kunnen vertalen naar andere vogel- of knaagdiermodellen.
De auditieve hersenstamrespons (ABR) is een onschatbare test in klinische audiologie, niet-menselijke dieren en menselijk onderzoek. Ondanks het wijdverbreide gebruik van ABRs bij het meten van auditieve neurale synchronie en het schatten van de gehoorgevoeligheid in andere gewervelde modelsystemen, zijn methoden voor het registreren van ABRs in de kip in bijna vier decennia niet gerapporteerd. Kippen bieden een robuust dieronderzoeksmodel omdat hun auditieve systeem bijna functioneel rijpt tijdens late embryonale en vroege broedstadia. We hebben methoden gedemonstreerd die worden gebruikt om een of tweekanaals ABR-opnames uit te lokken met behulp van subdermale naaldelektrode-arrays in kippenbroedjes. Ongeacht de elektrode-opnameconfiguratie (d.w.z. montage), omvatten ABR-opnames 3-4 positief lopende piekgolfvormen binnen de eerste 6 ms van een suprathreshold-klikprikkel. Piek-tot-dalgolfvormamplitudes varieerden van 2-11 μV bij hoge intensiteitsniveaus, waarbij positieve pieken verwachte latentie-intensiteitsfuncties vertoonden (d.w.z. toename van de latentie als functie van verminderde intensiteit). Gestandaardiseerde oortelefoonpositie was van cruciaal belang voor optimale opnames, omdat een losse huid de gehoorgang kan afsluiten en dierlijke beweging de stimulustransducer kan losmaken. Piekamplitudes waren kleiner en latenties waren langer naarmate de lichaamstemperatuur van dieren daalde, wat de noodzaak voor het handhaven van fysiologische lichaamstemperatuur ondersteunde. Voor jonge jongen (<3 uur na het uitkomen dag 1) werden de drempels verhoogd met ~ 5 dB, pieklatenties namen toe ~ 1-2 ms en piek tot dal amplitudes waren verlaagd ~ 1 μV in vergelijking met oudere jongen. Dit suggereert een mogelijk geleidend gerelateerd probleem (d.w.z. vloeistof in de middenoorholte) en moet worden overwogen voor jonge jongen. Over het algemeen maken de hier beschreven ABR-methoden een nauwkeurige en reproduceerbare registratie van de in-vivo auditieve functie bij kippenbroedjes mogelijk die kan worden toegepast op verschillende stadia van ontwikkeling. Dergelijke bevindingen zijn gemakkelijk te vergelijken met menselijke en zoogdiermodellen van gehoorverlies, veroudering of andere auditief gerelateerde manipulaties.
De studie van opgeroepen neurale reacties op geluidsprikkels dateert van meer dan een halve eeuw1. De auditieve hersenstamrespons (ABR) is een opgeroepen potentieel dat al tientallen jaren wordt gebruikt als een maat voor de auditieve functie bij zowel niet-menselijke dieren als mensen. De menselijke ABR presenteert met vijf tot zeven golfvormpieken conventioneel gelabeld met Romeinse cijfers (I-VII)2. Deze pieken worden geanalyseerd op basis van hun latentie (tijd van optreden in milliseconden) en amplitude (piek-tot-dalgrootte in microvolts) van de neurale responsen. De ABR speelt een belangrijke rol bij het evalueren van de functie en integriteit van de gehoorzenuw, evenals de gevoeligheid van de hersenstam en gehoordrempel. Tekorten in het auditieve systeem resulteren in afwezige, verminderde, langdurige of abnormale ABR-latenties en amplitudes. Opmerkelijk is dat deze parameters bijna identiek zijn bij mensen en andere dieren, waardoor het een consistente objectieve test is van de auditieve functie van gewervelde modellen3.
Een dergelijk modelsysteem is de kip, en het is vooral handig om verschillende redenen. Vogels kunnen worden geclassificeerd als altriciaal of precocial4. Altricial vogels komen uit met zintuigen die nog in ontwikkeling zijn; kerkuilen vertonen bijvoorbeeld pas vier dagen na luik5 een consistente ABR. Vroegrijpe dieren zoals de kip komen uit met bijna volwassen zintuigen. Het begin van het gehoor treedt op bij de embryonale ontwikkeling, zodat dagen voor het uitkomen (embryonale dag 21), het auditieve systeem in de buurt van functionele rijpingis 6,7,8. Altriciale vogels en de meeste zoogdiermodellen zijn gevoelig voor extrinsieke factoren die de ontwikkeling beïnvloeden en vereisen veehouderij totdat het gehoor volwassen is. Kippen-ABRs kunnen dezelfde dag als het luik worden uitgevoerd, waardoor de behoefte aan voeding of een verrijkte omgeving wordt opgegeven.
De embryonale kip is een goed bestudeerd model voor fysiologie en ontwikkeling, vooral in de auditieve hersenstam. Specifieke structuren omvatten de cochleaire kern van de kip, verdeeld in nucleus magnocellularis (NM) en nucleus angularis (NA), en de aviaire correlatie van de mediale superieure olijf bekend als nucleus laminaris (NL)6,7. De ABR is ideaal om te focussen op de centrale auditieve functie vóór het niveau van de voorhersenen en cortex. Vertaling tussen in-vivo ABR-metingen jp in-vitro neuronale studies van ontwikkeling8, fysiologie9, tonotopie10 en genetica11,12 biedt ideale onderzoeksmogelijkheden die studies van de algehele auditieve functie ondersteunen.
Hoewel de ABR uitgebreid is bestudeerd in zoogdiermodellen, is er minder aandacht geweest voor vogels. Eerdere aviaire ABR-studies omvatten karakteriseringen van de grasparkiet13, specht14, meeuw15, duikvogels16, zebravink17, dagactieve roofvogels18, kanarie19, drie soorten uil 5,20,21,22 en kip23. Gezien de bijna vier decennia sinds de laatste grondige karakterisering van de kip ABR, zijn veel van de eerder gebruikte apparatuur en technieken veranderd. Inzichten uit studies in andere vogelmodellen kunnen helpen bij het ontwikkelen van de moderne ABR-methodologie voor kippen, terwijl ze ook dienen als een vergelijking met de kip-ABR. Dit artikel zal de experimentele opstelling en het ontwerp schetsen om ABR-registratie bij broedkippen mogelijk te maken die ook kan worden toegepast op embryonale ontwikkelingsstadia en andere kleine knaagdier- en vogelmodellen. Bovendien, gezien de vroegrijpe ontwikkeling van de kip, kunnen ontwikkelingsmanipulaties worden uitgevoerd zonder uitgebreide veehouderij. Manipulaties aan een zich ontwikkelend embryo kunnen slechts een paar uur nadat het dier uitkomt met bijna volwassen gehoorvermogen worden geëvalueerd.
De auditieve hersenstam van vogels is goed bestudeerd en veel structuren zijn analoog aan de auditieve route van zoogdieren. De gehoorzenuw levert exciterende inputs op de twee eerste orde centrale kernen, de cochleaire nucleus magnocellularis (NM) en angularis (NA). NM stuurt bilateraal een exciterende projectie naar zijn auditieve doel, nucleus laminaris (NL)7. NL projecten naar de nucleus mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. NL projecteert ook op de superieure olivaire nucleus (SON), die feedbackremming biedt aan NM, NA en NL42. Dit microcircuit van de onderste auditieve hersenstam is uitstekend bewaard gebleven voor de functie die het ondertekent, geluidslokalisatie en binauraal gehoor33. De bovenste auditieve hersenstamgebieden van de vogel hebben ook kernen analoog aan de laterale lemniscus van zoogdieren en inferieure colliculus in de middenhersenen. Gezien deze overeenkomsten is de samenstelling van de aviaire ABR tot aan de auditieve middenhersenen vergelijkbaar voor alle gewervelde dieren.
Hoewel meerdere vogelsoorten binnen 6 ms na het begin van de stimulus drie positieve pieken vertonen, heeft de correlatie van ABR-pieken met centrale auditieve structuren enige variabiliteit. Golf I kan redelijkerwijs worden verondersteld de eerste neurale respons te zijn van de perifere basilaire papilla en gehoorzenuw en vertoont weinig variabiliteit tussen individuen (figuur 1C). De identificatie van de volgende golf is minder zeker en kan per soort verschillen. Kuokkanen et al.17 hebben onlangs vastgesteld dat Wave III van de ABR van de kerkuil wordt gegenereerd door NL; het is dus redelijk om te stellen dat Golf II afkomstig is van NM en NA van de cochleaire kern20. De uil Wave III werd echter gedefinieerd als de positieve piek die 3 ms na het begin van de stimulus werd gegenereerd. Dit komt overeen met Wave II zoals gedefinieerd in de broedkip ABR. In de kerkuil ABR werden golven I en II gecombineerd.
Terwijl de broedkip meestal binnen 6 ms drie pieken vertoonde, werd af en toe een vierde piek waargenomen (zie bijvoorbeeld figuur 1A). Populatiegegevens, grotere steekproefomvang en aanvullende experimentele paradigma’s zouden nodig zijn om een vierde golf en in sommige gevallen een vijf-golf kip ABR te ondersteunen. De meest consistente bevinding waren de drie piekrepresentaties die hier worden getoond.
Aangezien de ABR wordt gedefinieerd als een maat voor neurale synchronie, kunnen de belangrijkste kernen in de auditieve route elke positief lopende piek in de ABR vertegenwoordigen. Het signaal dat van de gehoorzenuw naar NM/NA en vervolgens naar NL gaat, kan respectievelijk golven I, II en III in de broedkip ABR definiëren. Bovendien zou de later optredende vierde piek van de kip-ABR een bovenste hersenstam of middenhersenenale auditieve structuur kunnen vertegenwoordigen. De karakterisering van vogel-ABRs moet ook rekening houden met het verschil tussen precociale en altriciale vogels. De rijping van auditieve reacties varieert van soort tot soort en wordt ook beïnvloed door andere kritieke eigenschappen zoals roofdiergedrag en / of vocaal leren4. Hoe dan ook, de beschreven methoden en technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid aan vogel- en gewervelde soorten.
Het belang van het handhaven van de lichaamstemperatuur van dieren wordt geïllustreerd in figuur 2. Naarmate de interne lichaamstemperatuur afnam, nam de latentie van ABR-responsen toe voor hetzelfde stimulusintensiteitsniveau. Dit is meer uitgesproken wanneer de lichaamstemperatuur onder de 32 °C 36,37 daalt. De ongeveer 1 ms latentietoename in de ABR is minder dan eerder gemeld bij de kip23. Katayama23 gebruikte echter een 12 dagen oud jong dat werd gekoeld en vervolgens gedurende een periode van 4 uur werd opgewarmd. De gegevens in figuur 2 werden geregistreerd tijdens het koelproces gedurende een periode van 20 minuten. Om de beste kwaliteit en meest consistente opnames te verkrijgen, moet de lichaamstemperatuur van het dier worden gehandhaafd en moeten alle opnames bij dezelfde fysiologische temperatuur tussen dieren worden gedaan.
Het effect van leeftijd op de ABR is gering maar belangrijk om te overwegen. Hoewel alleen de latentie van Waves I en II van de ABR significant verschilde, komt dit deels omdat er slechts drie jonge jongen werden gebruikt in figuur 3; de andere drie presenteerden zich niet met drie identificeerbare ABR-pieken. ABR-amplitude en drempelverschuivingen kunnen ook duidelijk zijn bij het gebruik van grote steekproefgroottes of het vergelijken van frequentiespecifieke ABRs. Dit leeftijdsgebonden effect kan worden veroorzaakt door vocht in het middenoor van de kip. Dergelijke geleidende veranderingen leiden tot een duidelijke toename van de ABR-drempels voor zowel menselijke als andere zoogdiermodellen38,39.
Met behulp van twee verschillende opnamemontages werden vergelijkbare reacties waargenomen (figuur 4A). Hoewel de meest voorkomende montage de referentie-elektrode achter het stimulus ontvangende oor plaatst, kan het nuttig zijn om de referentie-elektrode in het nekweefsel te hebben als er een chirurgische ingreep is die gepaard gaat met de ABR. Als echter tweekanaals ABR-opnamen worden gebruikt, moeten de referentie-elektroden afzonderlijk en symmetrisch worden geplaatst, wat moeilijk is als de referentie-elektrode in de nek wordt geplaatst. De mastoïde positie voor de referentie-elektrode wordt aanbevolen om zoveel mogelijk aspecten van de opname te standaardiseren. Tweekanaals ABR-opname is een effectief hulpmiddel dat weinig extra voorbereiding vereist en resulteert in vergelijkbare reacties tussen de oren. Kleine amplitudeverschillen waren waarschijnlijk te wijten aan de positionering van de oortelefoon. Tweekanaals opname maakt een eenvoudige vergelijking mogelijk tussen een experimenteel gemanipuleerd oor of hersenhelft versus een controle. Deze opstelling zou ook nodig zijn voor het testen van binaurale ABRs. Toekomstige experimenten met de kip ABR kunnen verwijzen naar eerdere literatuur over opnameconfiguraties en montages34.
Deze methodologie heeft verschillende beperkingen. Zoals vermeld in stap 5.1, kan een slechte speculumplaatsing leiden tot een verschuiving van 40 dBSPL in reactie. Dit kan leiden tot een onjuiste interpretatie van een gemanipuleerd of gemodificeerd dier. De volgende voorzorgsmaatregelen worden aanbevolen: verkrijg een grote steekproef van controlegegevens voordat u de ABRs van gemanipuleerde of mutante modellen verwerft. Verlaag de stimulusintensiteit niet met meer dan 20 dBSPL tussen de opnames. Als de amplitude of latentie meer verschuift dan verwacht, controleert u de positie van het dier en het speculum. Herhaal die ABR-stimulus om veranderingen waar te nemen. Als het speculum is verplaatst, moet u eerdere tests opnieuw verkrijgen. Een andere beperking is de kalibratie van ABRs. Zonder de juiste kalibratie om het geluidsdrukniveau vast te leggen, is de intensiteit die aan het dier wordt gepresenteerd onbekend. Gebruik bij het meten van de geluidsuitvoer hetzelfde speculum als bij experimentele opname en een kleine microfoon in een holte die de gehoorganglengte van het dier benadert (~ 5 mm). Meet dezelfde toonfrequenties die in experimenten worden gebruikt, omdat kalibraties frequentiespecifiek zijn. De handleiding voor zowel hardware- als softwaresystemen kan worden geleverd met aanwijzingen voor kalibratie. Er zijn ook extra filters zoals lineaire fase- en minimale fasefilters, die klik- en toonuitbarsting ABRs43 kunnen verbeteren. Deze filters werden in dit onderzoek niet gebruikt. Aanvullende overwegingen, zoals de stijgings- en valtijd van een toonuitbarsting spectraal omhulsel dat verandert als functie van frequentie of het veranderen van de stijgings- en valtijd van de klikprikkels, werden ook niet onderzocht. Dit zijn goede toekomstige onderzoeken zodra betrouwbare en consistente ABRs kunnen worden verkregen.
De vergelijking van de broedkip met andere vogelmodellen is veelbelovend. Grasparkieten en oostelijke krijsuilen vertonen ook drie positieve microvoltpieken binnen de eerste 6 ms van de ABR13,22. Bij verschillende spechtensoorten worden ook drie pieken gezien, maar hun latentie is later in de tijd. Bovendien ligt het bereik van de beste frequentiegevoeligheid bij spechten tussen 1500 en 4000 Hz, wat iets hoger is dan de beste drempel van de kip bij 1000 Hz. Bij de volwassen kip is de beste gevoeligheid bij 2000 Hz35, dus er kan een verbeterd gehoor van hoge frequenties zijn naarmate kippenbroedjes zich ontwikkelen tot volwassenen. Die ontwikkeling zal verschillen tussen vogelsoorten, rekening houdend met de altriciale of vroegrijpe ontwikkeling van het dier4.
De experimentele methoden die hier worden beschreven, kunnen helpen bepalen welke factoren leiden tot nadelen of veranderingen in auditieve reacties en drempels, evenals studies in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling. Genetische manipulatie, veroudering en blootstelling aan lawaai zijn allemaal bekende manipulaties bij dieren en andere vogelmodellen 24,25,44,45. Deze methoden moeten worden uitgebreid naar het kippenmodel nu technieken zoals in-ovo-elektroporatie de expressie mogelijk maken van eiwitten die focal en temporeel worden gecontroleerd aan één kant van de auditieve hersenstam12,46. Dit maakt de directe vergelijking van ABRs van het genetisch gemanipuleerde oor met het contralaterale controleoor mogelijk met behulp van een tweekanaals opnameparadigma.
Over het algemeen is de ABR van broedkippen een nuttige onderzoeksmethode, bijna identiek aan metingen van de gehoorfunctie in menselijke en andere zoogdiermodellen. Het is ook een niet-invasieve, in-vivo methodologie. Afgezien van verdovingsinjectie en subdermale elektrodeplaatsing van enkele millimeters, is er geen andere fysieke manipulatie vereist. Een jong zou in theorie meerdere keren kunnen worden getest in een ontwikkelingstijd van dagen of weken als het in een geschikte omgeving wordt gehouden. Dit protocol beschrijft niet alleen de noodzakelijke stappen en registratieparameters voor de broedkip ABR, maar stelt ook kenmerken voor van een aviaire ABR die verdere tests naar de auditieve hersenstamfunctie kunnen informeren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door de NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |