概要

Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

Published: September 15, 2021
doi:

概要

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

Abstract

A capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano em saúde e doença é altamente limitada pela capacidade de modelar a complexidade do coração humano in vitro. O desenvolvimento de plataformas mais eficientes semelhantes a órgãos que podem modelar fenótipos complexos in vivo , como organoides e órgãos em um chip, aumentará a capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano e doenças. Este artigo descreve um protocolo para gerar organoides cardíacos humanos altamente complexos (hHOs) por auto-organização usando células-tronco pluripotentes humanas e ativação de caminhos de desenvolvimento stepwise usando inibidores de pequenas moléculas. Os corpos embrionários (EBs) são gerados em uma placa de 96 poços com fundo redondo, poços de fixação ultra-baixo, facilitando a cultura de suspensão de construções individualizadas.

Os EBs sofrem diferenciação em hHOs por uma estratégia de modulação de sinalização WNT de três etapas, que envolve uma ativação inicial da via WNT para induzir o destino do mesoderm cardíaco, um segundo passo da inibição de Wnt para criar linhagens cardíacas definitivas, e um terceiro passo de ativação wnt para induzir tecidos proepicardiais de órgãos. Essas etapas, realizadas em formato de 96 poços, são altamente eficientes, reprodutíveis e produzem grandes quantidades de organoides por execução. A análise por imagens de imunofluorescência do dia 3 ao dia 11 de diferenciação revela especificações de campo cardíaco de primeiro e segundo e tecidos de alta complexidade dentro dos HHOs no dia 15, incluindo tecido miocárdio com regiões de cardiomiócitos atrial e ventricular, bem como câmaras internas forradas com tecido endocardial. Os organoides também exibem uma intrincada rede vascular em toda a estrutura e um revestimento externo de tecido epicártico. Do ponto de vista funcional, os HHOs batem robustamente e apresentam atividade normal de cálcio, conforme determinado pela imagem ao vivo fluo-4. No geral, este protocolo constitui uma plataforma sólida para estudos in vitro em tecidos cardíacos semelhantes a órgãos humanos.

Introduction

Os defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são o tipo mais comum de defeito congênito em humanos e afetam aproximadamente 1% de todos os nascidos vivos1,2,3. Na maioria das circunstâncias, as razões para os CHDs permanecem desconhecidas. A capacidade de criar modelos de coração humano no laboratório que se assemelham muito ao coração humano em desenvolvimento constitui um passo significativo para estudar diretamente as causas subjacentes dos CHDs em humanos e não em modelos animais substitutos.

O epítome de modelos de tecido cultivados em laboratório são organoides, construções de células 3D que se assemelham a um órgão de interesse na composição celular e função fisiológica. Organoides são frequentemente derivados de células-tronco ou células progenitoras e têm sido usados com sucesso para modelar muitos órgãos como o cérebro4,5, rim6,7, intestino8,9, pulmão10,11, fígado12,13 e pâncreas14,15 , só para citar alguns. Estudos recentes surgiram demonstrando a viabilidade de criar organoides cardíacos auto-montados para estudar o desenvolvimento cardíaco in vitro. Esses modelos incluem o uso de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) para modelar o desenvolvimento cardíaco precoce16,17 até especificações atrioventriculares18 e células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para gerar organoides de endoderme de camada plamífica de camada plamícidos 19 e cardiodos de câmara20 com composição celular altamente complexa.

Este artigo apresenta um novo protocolo de modulação WNT de 3 passos para gerar hHOs altamente complexos de forma eficiente e econômica. Organoides são gerados em placas de 96 poços, resultando em um sistema escalável e de alta produtividade que pode ser facilmente automatizado. Este método se baseia na criação de agregados de hPSC e no desencadeamento de etapas de desenvolvimento da cardiogênese, incluindo mesodermia e formação de mesoderm cardíaco, especificação de primeiro e segundo campo cardíaco, formação de órgãos proepicardial e especificação atrioventricular. Após 15 dias de diferenciação, os HHOs contêm todas as principais linhagens celulares encontradas no coração, câmaras internas bem definidas, câmaras atrial e ventricular, e uma rede vascular em todo o organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado e reprodutível é favorável à investigação de análises estruturais, funcionais, moleculares e transcriômicas no estudo do desenvolvimento cardíaco e doenças e rastreamento farmacológico.

Protocol

1. cultura e manutenção hPSC NOTA: Os PSCs induzidos por humanos (hiPSCs) ou células-tronco embrionárias humanas (hESCs) precisam ser cultivados por pelo menos 2 passagens consecutivas após o descongelamento antes de serem usados para gerar EBs para diferenciação ou criopreservação. hPSCs são cultivados em meio PSC (ver a Tabela de Materiais) em placas de cultura de 6 poços revestidos de membrana de porão (BM-ECM) revestidos de 6 poços. Ao realizar alterações méd…

Representative Results

Para alcançar a auto-organização hHO in vitro, modificamos e combinamos protocolos de diferenciação previamente descritos para diferenciação de monocamadas 2D de células cardiomiocós-ástica21 e epicárida22 usando moduladores de via Wnt e para organoides pré-cardiaco 3D16 usando os fatores de crescimento BMP4 e Activin A. Utilizando a placa de 96 poços EB e protocolo de diferenciação hHO descritos aqui e mostrados na <strong cl…

Discussion

Avanços recentes em cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas e outras células de origem cardíaca têm sido usados para modelar o desenvolvimento do coração humano22,24,25 e doenças26,27,28 e como ferramentas para triagem de terapêutica29,30 e agentes <sup cla…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação K01HL135464 e R01HL15151505 e pela American Heart Association sob o prêmio número 19IPLOI34660342. Agradecemos ao Núcleo avançado de Microscopia da MSU e ao Dr. William Jackson do Departamento de Farmacologia e Toxicologia da MSU pelo acesso aos microscópios confocal, ao Núcleo de Microscopia de QI e ao Núcleo de Genômica da MSU para serviços de sequenciamento. Também queremos agradecer a todos os membros do Laboratório Aguirre por seus valiosos comentários e conselhos.

Materials

Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21202 1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21206 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21203 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21207 1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat Invitrogen A32849 1:200
HAND1 Abcam ab196622 Rabbit; 1:200
HAND2 Abcam ab200040 Rabbit; 1:200
NFAT2 Abcam ab25916 Rabbit; 1:100
PECAM1 DSHB P2B1 Rabbit; 1:50
TNNT2 Abcam ab8295 Mouse; 1:200
THY1 Abcam ab133350 Rabbit; 1:200
TJP1 Invitrogen PA5-19090 Goat; 1:250
VIM Abcam ab11256 Goat; 1:250
WT1 Abcam ab89901 Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase Innovative Cell Technologies NC9464543 cell dissociation reagent
Activin A R&D Systems 338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin) Gibco A1895601 insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement Gibco 17504-044 cell culture supplement
BMP-4 Gibco PHC9534
Bovine Serum Albumin Bioworld 50253966
CHIR-99021 Selleck 442310
D-(-)-Fructose Millipore Sigma F0127
DAPI Thermo Scientific 62248 1:1000
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 10566016
Essential 8 Flex Medium Kit Gibco A2858501 pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM Invitrogen F14201
Glycerol Millipore Sigma G5516
Glycine Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR Corning CB40230 Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum Millipore Sigma S30-100mL
Paraformaldehyde MP Biomedicals IC15014601 Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffer Solution Gibco 10010049
Phosphate Buffer Solution (10x) Gibco 70011044
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 73155 90 µm
ReLeSR Stem Cell Technologies NC0729236 dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640 Gibco 11875093
Thiazovivin Millipore Sigma SML1045
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Trypan Blue Solution Gibco 1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H170010
WNT-C59 Selleck NC0710557
その他
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02682002
15 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 1495970C
2 mL Cryogenic Vials Corning 13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs Fisherbrand 13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass Cellvis C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates Costar 07201680
ImageJ NIH Image processing software
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 06-666 laboratory wipes
Micro Cover Glass VWR 48393-241 24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides Fisherbrand 1255015
Moxi Cell Counter Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M Orflo Technologies MXC001
Multichannel Pipettes Fisherbrand FBE1200300 30-300 µL
Olympus cellVivo Olympus For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004261
Thermoshaker ThermoFisher Scientific 13-687-711PM
Top Coat Nail Varish Seche Vite Can purchase from any supermarket

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記事を引用
Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (175), e63097, doi:10.3791/63097 (2021).

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