Generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti
概要
Qui, descriviamo un protocollo per creare organoidi cardiaci umani rilevanti per lo sviluppo (hHO) in modo efficiente utilizzando cellule staminali pluripotenti umane mediante auto-organizzazione. Il protocollo si basa sull’attivazione sequenziale dei segnali di sviluppo e produce tessuti cardiaci umani altamente complessi e funzionalmente rilevanti.
Abstract
La capacità di studiare lo sviluppo cardiaco umano in salute e malattia è fortemente limitata dalla capacità di modellare la complessità del cuore umano in vitro. Lo sviluppo di piattaforme simili a organi più efficienti in grado di modellare fenotipi complessi in vivo , come organoidi e organi su chip, migliorerà la capacità di studiare lo sviluppo e le malattie del cuore umano. Questo documento descrive un protocollo per generare organoidi cardiaci umani (hHO) altamente complessi mediante auto-organizzazione utilizzando cellule staminali pluripotenti umane e attivazione graduale del percorso di sviluppo utilizzando inibitori di piccole molecole. I corpi embrioidi (EB) sono generati in una piastra a 96 pozzetti con fondo tondo e pozzi di attacco ultra-bassi, facilitando la coltura in sospensione di costrutti individualizzati.
Gli EB subiscono la differenziazione in hHO mediante una strategia di modulazione del segnale Wnt in tre fasi, che prevede un’attivazione iniziale della via Wnt per indurre il destino del mesoderma cardiaco, una seconda fase di inibizione Wnt per creare linee cardiache definitive e una terza fase di attivazione Wnt per indurre tessuti d’organo proepiardici. Questi passaggi, eseguiti in un formato a 96 pozzetti, sono altamente efficienti, riproducibili e producono grandi quantità di organoidi per corsa. L’analisi mediante imaging a immunofluorescenza dal giorno 3 al giorno 11 della differenziazione rivela le specifiche del primo e del secondo campo cardiaco e tessuti altamente complessi all’interno degli hHO al giorno 15, incluso il tessuto miocardico con regioni di cardiomiociti atriali e ventricolari, nonché camere interne rivestite di tessuto endocardico. Gli organoidi presentano anche un’intricata rete vascolare in tutta la struttura e un rivestimento esterno di tessuto epicardico. Da un punto di vista funzionale, gli hHO battono in modo robusto e presentano una normale attività del calcio come determinato dall’imaging dal vivo Fluo-4. Nel complesso, questo protocollo costituisce una solida piattaforma per studi in vitro in tessuti cardiaci simili a organi umani.
Introduction
I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto congenito nell’uomo e colpiscono circa l’1% di tutti i nati vivi1,2,3. Nella maggior parte dei casi, le ragioni dei CHD rimangono sconosciute. La capacità di creare modelli di cuore umano in laboratorio che assomigliano molto al cuore umano in via di sviluppo costituisce un significativo passo avanti per studiare direttamente le cause alla base dei CHD negli esseri umani piuttosto che in modelli animali surrogati.
L’epitome dei modelli tissutali cresciuti in laboratorio sono gli organoidi, costrutti cellulari 3D che assomigliano a un organo di interesse per la composizione cellulare e la funzione fisiologica. Gli organoidi sono spesso derivati da cellule staminali o cellule progenitrici e sono stati utilizzati con successo per modellare molti organi come il cervello4,5, il rene6,7, l’intestino8,9, il polmone10,11, il fegato12,13 e il pancreas14,15 , solo per citarne alcuni. Recenti studi sono emersi dimostrando la fattibilità della creazione di organoidi cardiaci auto-assemblanti per studiare lo sviluppo del cuore in vitro. Questi modelli includono l’utilizzo di cellule staminali embrionali di topo (mESC) per modellare lo sviluppo cardiaco precoce16,17 fino alla specifica atrioventricolare18 e cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per generare organoidi cardiaco-endodermici multi-strato germinale19 e cardioidi camerati20 con composizione cellulare altamente complessa.
Questo documento presenta un nuovo protocollo di modulazione WNT in 3 fasi per generare hHO altamente complessi in modo efficiente ed economico. Gli organoidi sono generati in piastre a 96 pozzetti, risultando in un sistema scalabile e ad alta produttività che può essere facilmente automatizzato. Questo metodo si basa sulla creazione di aggregati hPSC e sull’innesco di fasi di sviluppo della cardiogenesi, tra cui la formazione di mesoderma e mesoderma cardiaco, la specifica del primo e del secondo campo cardiaco, la formazione di organi proepiardici e la specifica atrioventricolare. Dopo 15 giorni di differenziazione, gli hHO contengono tutte le principali linee cellulari presenti nel cuore, camere interne ben definite, camere atriali e ventricolari e una rete vascolare in tutto l’organoide. Questo sistema organoide cardiaco altamente sofisticato e riproducibile è in grado di studiare analisi strutturali, funzionali, molecolari e trascrittomiche nello studio dello sviluppo cardiaco e delle malattie e dello screening farmacologico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I recenti progressi nei cardiomiociti derivati da cellule staminali umane e in altre cellule di origine cardiaca sono stati utilizzati per modellare lo sviluppo del cuore umano22,24,25 e la malattia26,27,28 e come strumenti per lo screening di terapie29,30 e agenti <sup class="…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con i numeri di premio K01HL135464 e R01HL151505 e dall’American Heart Association con il numero di premio 19IPLOI34660342. Desideriamo ringraziare il MSU Advanced Microscopy Core e il Dr. William Jackson presso il Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia della MSU per l’accesso ai microscopi confocali, al Nucleo di Microscopia QI e al Nucleo di Genomica MSU per i servizi di sequenziamento. Desideriamo anche ringraziare tutti i membri dell’Aguirre Lab per i loro preziosi commenti e consigli.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| その他 | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
参考文献
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