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生化学

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

Published: September 15, 2021
doi:
10.3791/63097
, , , ,
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology,Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Michigan State University

概要

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。

Abstract

健康と病気におけるヒト心臓の発達を研究する能力は、 インビトロでのヒト心臓の複雑さをモデル化する能力によって非常に制限される。オルガノイドやオルガンオンチップなどの複雑な 生体内 表現型をモデル化できる、より効率的な臓器のようなプラットフォームを開発することは、人間の心臓の発達と病気を研究する能力を高めるでしょう。本論文では、ヒト多能性幹細胞を用いた自己組織化と、低分子阻害剤を用いた段階的発達経路活性化により、非常に複雑なヒト心臓オルガノイド(hH)を生成するプロトコルについて述べている。胚体(EBs)は、ラウンドボトム、超低付着ウェルを備えた96ウェルプレートで生成され、個別の構築物の懸濁培養を促進します。

EBsは、心臓中皮運命を誘導するための最初のWnt経路活性化、決定的な心臓系統を作成するためのWnt阻害の第2ステップ、および前EPICAR組織を誘導する第3のWnt活性化ステップを含む3段階のWntシグナル伝達変調戦略によってhHOsへの分化を受ける。これらのステップは、96ウェル形式で行われ、非常に効率的で再現性が高く、1回の実行ごとに大量のオルガノイドを生成します。分化の3日目から11日目までの免疫蛍光イメージングによる分析は、心房および心室心筋細胞の領域を有する心筋組織および内腔内の内膜組織を含む、15日目のhHOs内の第1および第2の心臓フィールド仕様および非常に複雑な組織を明らかにする。オルガノイドはまた、構造全体に複雑な血管ネットワークを示し、外膜組織の外部内層を示す。機能的な観点から、hHOsは強く打ち負かし、Fluo-4ライブイメージングによって決定される正常なカルシウム活性を示す。全体として、このプロトコルは、ヒト臓器様心臓組織 におけるインビトロ 研究のための強固なプラットフォームを構成する。

Introduction

先天性心不全(CHD)は、ヒトにおける先天性欠損の最も一般的なタイプであり、全ての出生の約1%に影響を及ぼす1,2,3。ほとんどの場合、CHD の理由は不明のままです。開発中の人間の心臓に近いヒトの心臓モデルを実験室で作成する能力は、代理動物モデルではなく、ヒトにおけるCHDの根本的な原因を直接研究するための重要な前進を構成する。

実験室で成長した組織モデルの縮図は、細胞組成および生理機能に関心のある器官に似たオルガノイド、3D細胞構築物である。オルガノイドは幹細胞や前駆細胞に由来することが多く、脳4,5、腎臓6、7、腸8、9、肺10、11、肝臓12,13、膵臓などの多くの臓器のモデル化に成功しています14,15、ちょうどいくつかの名前を付けるために。最近の研究は、体外で心臓の発達を研究するために自己集合性心臓オルガノイドを作成する実現可能性を実証することが明らかになってきました。これらのモデルには、マウス胚性幹細胞(mESC)を使用して、房室仕様18までの初期心臓発達16,17、ヒト多能性幹細胞(hPSC)をモデル化し、多発層心内膜オルガノイド19および非常に複雑な細胞組成を有するチャンバードカーディオイド20を生成することを含む。

本論文は、高い複雑なhHOsを効率的かつ費用対効果の高い方法で生成するための、新しい3段階のWNT変調プロトコルを紹介する。オルガノイドは96ウェルプレートで生成され、容易に自動化できるスケーラブルでハイスループットなシステムをもたらします。この方法は、中皮および心中皮形成、第1および第2の心臓フィールド仕様、前EPICAR器官形成、および房室仕様を含む、hPSC凝集体を作成し、心新生の発達段階を引き起こすことに依存する。分化の15日後、hhOsは、心臓に見られるすべての主要な細胞系統、明確に定義された内部チャンバー、心房および心室室、およびオルガノイド全体の血管ネットワークを含む。この高度で再現性の高い心臓オルガノイドシステムは、心臓の発達、疾患、薬理学的スクリーニングの研究において、構造的、機能的、分子的、および転写学的分析を調査するのに適しています。

Protocol

1. hPSCの文化とメンテナンス 注:ヒト誘導PSC(hiPSC)またはヒト胚性幹細胞(hESC)は、分化またはさらなる凍結保存のためにEBを生成するために使用される前に、解凍後に少なくとも2回連続した通路のために培養する必要があります。hPSCは、基質膜外細胞マトリックス(BM-ECM)コーティングされた6ウェル培養プレート上のPSC培地( 材料表参照)で培養される。6ウェルプレ…

Representative Results

インビトロで自己組織化hHOを達成するために、我々は、Wnt経路モジュレーターを使用した心筋細胞21および心外細胞22の2D単層分化および成長因子BMP4およびアクチビンAを用いた3D前心臓オルガノイド16に関して以前に説明した分化プロトコルを修正し、組み合わせた図Wnt経路活性化因子CHIR99021の濃度と曝露期間?…

Discussion

ヒト幹細胞由来心筋細胞および心臓由来の他の細胞の最近の進歩は、ヒト心臓の発達22,24,25および疾患26,27,28をモデル化し、治療をスクリーニングするためのツールとして使用されています29,30および有毒物質31,32<…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464とR01HL151505の下で、および賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされました。MSU薬理毒性学科のMSUアドバンスト顕微鏡コアとウィリアム・ジャクソン博士は、コンフォーカル顕微鏡、IQ顕微鏡コア、シーケンシングサービスのためのMSUゲノミクスコアへのアクセスに感謝したいと思います。また、アギーレラボのメンバーの皆様の貴重なコメントやアドバイスに感謝申し上げたいと思います。

Materials

Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21202 1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21206 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21203 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21207 1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat Invitrogen A32849 1:200
HAND1 Abcam ab196622 Rabbit; 1:200
HAND2 Abcam ab200040 Rabbit; 1:200
NFAT2 Abcam ab25916 Rabbit; 1:100
PECAM1 DSHB P2B1 Rabbit; 1:50
TNNT2 Abcam ab8295 Mouse; 1:200
THY1 Abcam ab133350 Rabbit; 1:200
TJP1 Invitrogen PA5-19090 Goat; 1:250
VIM Abcam ab11256 Goat; 1:250
WT1 Abcam ab89901 Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase Innovative Cell Technologies NC9464543 cell dissociation reagent
Activin A R&D Systems 338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin) Gibco A1895601 insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement Gibco 17504-044 cell culture supplement
BMP-4 Gibco PHC9534
Bovine Serum Albumin Bioworld 50253966
CHIR-99021 Selleck 442310
D-(-)-Fructose Millipore Sigma F0127
DAPI Thermo Scientific 62248 1:1000
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 10566016
Essential 8 Flex Medium Kit Gibco A2858501 pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM Invitrogen F14201
Glycerol Millipore Sigma G5516
Glycine Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR Corning CB40230 Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum Millipore Sigma S30-100mL
Paraformaldehyde MP Biomedicals IC15014601 Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffer Solution Gibco 10010049
Phosphate Buffer Solution (10x) Gibco 70011044
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 73155 90 µm
ReLeSR Stem Cell Technologies NC0729236 dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640 Gibco 11875093
Thiazovivin Millipore Sigma SML1045
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Trypan Blue Solution Gibco 1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H170010
WNT-C59 Selleck NC0710557
その他
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02682002
15 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 1495970C
2 mL Cryogenic Vials Corning 13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs Fisherbrand 13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass Cellvis C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates Costar 07201680
ImageJ NIH Image processing software
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 06-666 laboratory wipes
Micro Cover Glass VWR 48393-241 24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides Fisherbrand 1255015
Moxi Cell Counter Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M Orflo Technologies MXC001
Multichannel Pipettes Fisherbrand FBE1200300 30-300 µL
Olympus cellVivo Olympus For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004261
Thermoshaker ThermoFisher Scientific 13-687-711PM
Top Coat Nail Varish Seche Vite Can purchase from any supermarket
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参考文献

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記事を引用
Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (175), e63097, doi:10.3791/63097 (2021).
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