Este protocolo de disociación de células neuronales está destinado a muestras con una baja cantidad de material de partida y produce una suspensión unicelular altamente viable para el análisis posterior, con pasos opcionales de fijación y tinción.
Este protocolo de disociación neuronal (una adaptación del protocolo que acompaña a un kit comercial de disociación cerebral adulta) optimiza el procesamiento de tejidos en preparación para análisis detallados aguas abajo, como la citometría de flujo o la secuenciación de una sola célula. La disociación neuronal se puede llevar a cabo a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de las mismas. La naturaleza delicada de las células neuronales puede complicar los esfuerzos para obtener la suspensión unicelular verdadera y altamente viable con un mínimo de desechos celulares que se requiere para el análisis de una sola célula. Los datos demuestran que esta combinación de disociación mecánica automatizada y digestión enzimática produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable (>90%), superando las dificultades antes mencionadas. Si bien algunos de los pasos requieren destreza manual, estos pasos disminuyen el manejo de muestras y la posible pérdida de células. Este manuscrito detalla cada paso del proceso para equipar a otros laboratorios para disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural en preparación para el análisis posterior.
El hipocampo fue descrito por primera vez por un anatomista boloñés, Giulio Cesare Aranzio, en la década de 15001. Al nombrar esta nueva estructura, Aranzio probablemente se inspiró en su extraño parecido con el caballito de mar del género Hippocampus1. El hipocampo está involucrado en las respuestas al estrés, pero es ampliamente conocido por su papel en el aprendizaje y la memoria. Más específicamente, el hipocampo es responsable de la codificación y recuperación de la memoria declarativa y espacial1.
El hipocampo, o hipocampo propiamente dicho, se divide en los subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 y CA31. En comparación con el resto del sistema nervioso, el hipocampo tiene varias características definitorias únicas, incluida su plasticidad y potencial para la neurogénesis en curso2. La neurogénesis es el proceso de proliferación y diferenciación de las células madre neurales, seguido de su integración en la red neuronal preexistente. La neurogénesis se restringe a la zona subgranular del giro dentado y a la zona subventricular de los ventrículos laterales (y los bulbos olfativos)3. Si bien la neurogénesis es abundante en la embriogénesis, es un proceso de por vida 3,4. Como tal, esta discusión se centrará en la neurogénesis adulta en el hipocampo.
Las zonas subventricular y subgranular son nichos neurogénicos que contienen células ependimarias y vasculares, así como linajes inmaduros y maduros de células madre neurales5. La microglía contribuye a estos nichos como células inmunes para regular la neurogénesis6. Las células progenitoras neurales son progenies de células no madre de células madre neurales7. Tres tipos de progenitores neurales están presentes en la zona subventricular: células tipo B similares a la glía radial, progenitores amplificadores de tránsito tipo C y neuroblastos tipo A 3,8. Las células progenitoras neurales tipo B que se dividen lentamente en la zona subventricular pueden diferenciarse en células tipo C que se dividen rápidamente8. Posteriormente, las células de tipo C se diferencian en células de tipo A8. Estos neuroblastos migran a través de la corriente migratoria rostral hasta el bulbo olfatorio antes de diferenciarse en interneuronas u oligodendrocitos9. Estas interneuronas del bulbo olfatorio son clave para la memoria olfativa a corto plazo y el aprendizaje asociativo, mientras que los oligodendrocitos mielinizan los axones del cuerpo calloso9. La mayoría de la neurogénesis adulta ocurre en la zona subgranular del giro dentado, donde se encuentran progenitores neurales radiales tipo 1 y no radiales tipo 23. La mayoría de las células progenitoras neurales están destinadas a convertirse en neuronas granulosas dentadas y astrocitos10. Conectados por uniones de brecha, los astrocitos forman redes para modular la plasticidad, la actividad sináptica y la excitabilidad neuronal5. Como neurona excitadora primaria del giro dentado, las células granulares proporcionan entrada desde la corteza entorrinal a la región CA311.
Las poblaciones de células madre neurales pueden aislarse utilizando estrategias de aislamiento inmunomagnético o inmunofluorescente12,13. El tejido neural es particularmente difícil de disociar; los esfuerzos para hacerlo a menudo resultan en muestras con poca viabilidad celular y / o no producen la suspensión de una sola célula necesaria para el análisis posterior. La disociación neuronal se puede realizar a través de la disociación mecánica (como el uso de filtros, técnicas de corte o trituración de pipetas), digestión enzimática o una combinación de técnicas14,15. En un estudio que evaluó los métodos de disociación neural, se comparó la viabilidad y calidad de la disociación mecánica manual por trituración de pipetas versus combinaciones de trituración de pipetas y digestión con diversas enzimas15. La calidad se calificó en función de la cantidad de grupos celulares y ADN o restos subcelulares en la suspensión preparada15. Las suspensiones de tumores gliales sometidos a disociación mecánica manual sola tuvieron una viabilidad celular significativamente menor que los tratamientos con dispasa o una combinación de DNasa, colagenasa e hialuronidasa15. Volovitz et al. reconocieron la variación en viabilidad y calidad entre los diferentes métodos y enfatizaron que una disociación inadecuada puede reducir la precisión del análisis aguas abajo15.
En un estudio separado, los autores compararon más de 60 métodos y combinaciones diferentes de disociación de células neuronales cultivadas14. Estos métodos incluyeron ocho variaciones diferentes de disociación mecánica manual por trituración de pipetas, una comparación de la incubación con cinco enzimas individuales a tres intervalos diferentes y varias combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática o la combinación de dos enzimas14. Ninguno de los métodos mecánicos produjo una suspensión de una sola célula14. Cuatro de los tratamientos de enzima única, diez de los tratamientos enzimáticos combinados y cuatro de las combinaciones de disociación mecánica con digestión enzimática produjeron una suspensión de una sola célula14. La digestión enzimática con TrypLE seguida de las muestras disociadas de Tripsina-EDTA de manera más efectiva14. Por cierto, las muestras tratadas con TrypLE y/o Tripsina-EDTA tendían a formar grupos gelatinosos14. Si bien este estudio se realizó en células cultivadas, habla de las deficiencias de la trituración de pipetas o la digestión enzimática sola.
Faltan comparaciones lado a lado de la disociación mecánica manual versus automatizada. Sin embargo, un grupo ejecutó la citometría de flujo para comparar la disociación mecánica manual y semiautomatizada de cerebros de ratones enteros junto con kits de disociación enzimática de papaína comercial o tripsina16. El procesamiento con el disociador produjo células viables de manera más consistente16. Después de la disociación, los autores también aislaron células prominina-1, células precursoras neuronales y microglia16. Para dos de las tres poblaciones de células aisladas, la pureza de las células aisladas fue ligeramente mayor cuando las muestras se procesaron con el disociador, en comparación con16 manualmente. Reiß et al. señalaron que la variabilidad de persona a persona en la técnica de pipeteo dificulta la reproducibilidad del rendimiento de la población celular viable en la disociación tisular16. Los autores concluyeron que la disociación mecánica automatizada estandariza el procesamiento de muestras16.
El método de disociación descrito en este manuscrito es una combinación de disociación mecánica totalmente automatizada y digestión enzimática, utilizando soluciones que acompañan a un kit comercial de disociación cerebral adulta17. A diferencia de los protocolos estándar, este protocolo optimizado reduce la manipulación de muestras, produce una suspensión unicelular altamente viable y está destinado a procesar cantidades mínimas de tejido de partida.
Varios pasos en este protocolo de disociación neuronal requieren una técnica competente y destreza: perfusión, aspiración sobrenadante y eliminación de mielina. Durante todo el proceso de perfusión, los órganos internos deben permanecer intactos (aparte de extirpar el diafragma y recortar el corazón); esto incluye evitar las cámaras superiores del corazón con la aguja de mariposa. Si bien la cantidad de solución salina con heparina necesaria varía, el líquido transparente que fluye desde el corazón indica q…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Aimee Rogers por proporcionar capacitación práctica y soporte continuo del producto. Agradecemos a la Dra. Amanda Burke por la solución de problemas en curso y las discusiones aclaratorias. Agradecemos a Meredith Joheim y al Grupo de Comunicación Científica de la UAMS por la edición gramatical y el formato de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH R25GM083247 y NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
BD LSRFortessa | BD | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |