Dit neurale celdissociatieprotocol is bedoeld voor monsters met een lage hoeveelheid uitgangsmateriaal en levert een zeer levensvatbare eencellige suspensie op voor downstream-analyse, met optionele fixatie- en kleuringsstappen.
Dit neurale dissociatieprotocol (een aanpassing van het protocol bij een commerciële hersendissociatiekit voor volwassenen) optimaliseert weefselverwerking ter voorbereiding op gedetailleerde downstream-analyse zoals flowcytometrie of eencellige sequencing. Neurale dissociatie kan worden uitgevoerd via mechanische dissociatie (zoals het gebruik van filters, haktechnieken of pipettrituratie), enzymatische spijsvertering of een combinatie daarvan. De delicate aard van neuronale cellen kan de inspanningen bemoeilijken om de zeer levensvatbare, echte eencellige suspensie te verkrijgen met minimaal cellulair puin dat nodig is voor eencellige analyse. De gegevens tonen aan dat deze combinatie van geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering consequent een zeer levensvatbare (>90%) eencellige suspensie oplevert, waarmee de bovengenoemde problemen worden overwonnen. Hoewel een paar van de stappen handmatige behendigheid vereisen, verminderen deze stappen de verwerking van monsters en mogelijk celverlies. Dit manuscript beschrijft elke stap van het proces om andere laboratoria uit te rusten om met succes kleine hoeveelheden neuraal weefsel te dissociëren ter voorbereiding op downstream-analyse.
De hippocampus werd voor het eerst beschreven door een Bolognese anatoom, Giulio Cesare Aranzio, in de jaren 15001. Bij het benoemen van deze nieuw ontdekte structuur werd Aranzio waarschijnlijk geïnspireerd door de griezelige gelijkenis met het zeepaardje van het geslacht Hippocampus1. De hippocampus is betrokken bij stressreacties, maar staat algemeen bekend om zijn rol in leren en geheugen. Meer specifiek is de hippocampus verantwoordelijk voor het coderen en ophalen van declaratief en ruimtelijk geheugen1.
De hippocampus, of eigenlijke hippocampus, is verdeeld in de SUBVELDEN CA1 (cornu ammonis), CA2 en CA3. In vergelijking met de rest van het zenuwstelsel heeft de hippocampus verschillende unieke bepalende kenmerken, waaronder de plasticiteit en het potentieel voor voortdurende neurogenese2. Neurogenese is het proces van de proliferatie en differentiatie van neurale stamcellen, gevolgd door hun integratie in het reeds bestaande neuronale netwerk. Neurogenese is beperkt tot de subgranulaire zone van de gyrus dentate en de subventriculaire zone van de laterale ventrikels (en de olfactorische bollen)3. Hoewel neurogenese overvloedig aanwezig is in embryogenese, is het een levenslang proces 3,4. Als zodanig zal deze discussie zich richten op volwassen neurogenese in de hippocampus.
De subventriculaire en subgranulaire zones zijn neurogene niches die ependymale en vasculaire cellen bevatten, evenals onrijpe en volwassen afstammingslijnen van neurale stamcellen5. Microglia dragen bij aan deze niches als immuuncellen om neurogenese te reguleren6. Neurale voorlopercellen zijn niet-stamcelprogenieën van neurale stamcellen7. Drie soorten neurale voorlopers zijn aanwezig in de subventriculaire zone: radiale glia-achtige type B-cellen, type C transit-versterkende voorlopers en type A neuroblasten 3,8. De langzaam delende type B neurale voorlopercellen in de subventriculaire zone kunnen differentiëren in snel delende type C-cellen8. Vervolgens differentiëren type C-cellen in type A-cellen8. Deze neuroblasten migreren door de rostrale migratiestroom naar de bulbus olfactorius voordat ze differentiëren in interneuronen of oligodendrocyten9. Deze olfactorische bolintercurnen zijn de sleutel tot olfactorisch kortetermijngeheugen en associatief leren, terwijl de oligodendrocyten myelinaat axonen van het corpus callosum9. De meerderheid van de volwassen neurogenese vindt plaats in de subgranulaire zone van de gyrus dentate, waar radiale type 1 en niet-radiale type 2 neurale voorlopers worden gevonden3. De meeste neurale voorlopercellen zijn voorbestemd om dentate granulaatneuronen en astrocyten10 te worden. Verbonden door gap junctions, vormen astrocyten netwerken om plasticiteit, synaptische activiteit en neuronale prikkelbaarheid te moduleren5. Als het primaire exciterende neuron van de gyrus dentate leveren korrelcellen input van de entorhinale cortex naar het CA3-gebied11.
Neurale stamcelpopulaties kunnen worden geïsoleerd met behulp van immunomagnetische of immunofluorescente isolatiestrategieën12,13. Neuraal weefsel is bijzonder moeilijk te dissociëren; pogingen om dit te doen resulteren vaak in monsters met een slechte levensvatbaarheid van de cel en/ of het niet produceren van de noodzakelijke eencellige suspensie voor downstream-analyse. Neurale dissociatie kan worden uitgevoerd via mechanische dissociatie (zoals het gebruik van filters, haktechnieken of pipettrituratie), enzymatische spijsvertering of een combinatie van technieken14,15. In een studie die neurale dissociatiemethoden evalueerde, werden de levensvatbaarheid en kwaliteit van handmatige mechanische dissociatie door pipettrituratie versus combinaties van pipettrituratie en spijsvertering met verschillende enzymen vergeleken15. De kwaliteit werd beoordeeld op basis van de hoeveelheid celklonten en DNA of subcellulair puin in de bereide suspensie15. Suspensies van gliale tumoren onderworpen aan handmatige mechanische dissociatie alleen hadden een significant lagere cel levensvatbaarheid dan behandelingen met dispase of een combinatie van DNase, collagenase en hyaluronidase15. Volovitz et al. erkenden de variatie in levensvatbaarheid en kwaliteit tussen de verschillende methoden en benadrukten dat onvoldoende dissociatie de nauwkeurigheid van downstream-analyse kan verminderen15.
In een afzonderlijke studie vergeleken de auteurs meer dan 60 verschillende methoden en combinaties van dissociatie van gekweekte neuronale cellen14. Deze methoden omvatten acht verschillende variaties van handmatige mechanische dissociatie door pipettrituratie, een vergelijking van incubatie met vijf individuele enzymen met drie verschillende intervallen en verschillende combinaties van mechanische dissociatie met enzymatische spijsvertering of de combinatie van twee enzymen14. Geen van de mechanische methoden leverde een eencellige suspensieop 14. Vier van de enkelvoudige enzymbehandelingen, tien van de combinatie-enzymatische behandelingen en vier van de combinaties van mechanische dissociatie met enzymatische vertering leverden een eencellige suspensie op14. Enzymatische vertering met TrypLE gevolgd door Trypsine-EDTA meest effectief gedissocieerde monsters14. Overigens hadden monsters behandeld met TrypLE en/of Trypsine-EDTA de neiging gelatineuze klontente vormen 14. Hoewel deze studie werd uitgevoerd op gekweekte cellen, spreekt het over de tekortkomingen van pipettrituratie of enzymatische spijsvertering alleen.
Zij-aan-zij vergelijkingen van handmatige versus geautomatiseerde mechanische dissociatie ontbreken. Eén groep voerde echter flowcytometrie uit om handmatige en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van hele muizenhersenen te vergelijken in combinatie met commerciële papaïne- of trypsine-enzymatische dissociatiekits16. Verwerking met de dissociator leverde consistenter levensvatbare cellen op16. Na dissociatie isoleerden de auteurs ook Prominine-1-cellen, neuronale voorlopercellen en microglia16. Voor twee van de drie geïsoleerde celpopulaties was de zuiverheid van de geïsoleerde cellen iets hoger wanneer monsters werden verwerkt met de dissociator, in vergelijking met handmatig16. Reiß et al. merkten op dat person-to-person variabiliteit in pipetteertechniek de reproduceerbaarheid van levensvatbare celpopulatieopbrengst in weefseldissociatie belemmert16. De auteurs concludeerden dat geautomatiseerde mechanische dissociatie de monsterverwerking standaardiseert16.
De methode van dissociatie die in dit manuscript wordt beschreven, is een combinatie van volledig geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering, met behulp van oplossingen die gepaard gaan met een commerciële hersendissociatiekit voor volwassenen17. In tegenstelling tot standaardprotocollen vermindert dit geoptimaliseerde protocol monstermanipulatie, levert het een zeer levensvatbare eencellige suspensie op en is het bedoeld voor het verwerken van minimale hoeveelheden startweefsel.
Verschillende stappen in dit neurale dissociatieprotocol vereisen bekwame techniek en behendigheid – perfusie, supernatantaspiratie en myelineverwijdering. Tijdens het perfusieproces moeten de inwendige organen intact blijven (afgezien van het verwijderen van het diafragma en het knippen van het hart); dit omvat het vermijden van de bovenste kamers van het hart met de vlindernaald. Hoewel de hoeveelheid zoutoplossing met heparine die nodig is varieert, geeft transparante vloeistof die uit het hart stroomt aan dat het pro…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Aimee Rogers voor het bieden van hands-on training en voortdurende productondersteuning. We bedanken Dr. Amanda Burke voor het voortdurend oplossen van problemen en het verduidelijken van discussies. We bedanken Meredith Joheim en de UAMS Science Communication Group voor de grammaticale redactie en opmaak van dit manuscript. Deze studie werd ondersteund door NIH R25GM083247 en NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
BD LSRFortessa | BD | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |