דיסוציאציה מכנית ואנזימטית משולבת של רקמת היפוקמפל במוח העכבר

ההיפוקמפוס תואר לראשונה על ידי אנטומיסט בולונזי, ג’וליו צ’זארה ארנציו, בשנות ה-1500 של^{המאה ה-15}. במתן שם למבנה החדש הזה, ארנציו ככל הנראה קיבל השראה מהדמיון המובהק שלו לסוסון הים של הסוג היפוקמפוס¹. ההיפוקמפוס מעורב בתגובות עקה אך ידוע בתפקידו בלמידה ובזיכרון. ליתר דיוק, ההיפוקמפוס אחראי על קידוד ואחזור של זיכרון הצהרתי ומרחבי¹.

ההיפוקמפוס, או ההיפוקמפוס עצמו, מחולק לתת-שדות CA1 (cornu ammonis), CA2 ו-CA3¹. בהשוואה לשאר מערכת העצבים, להיפוקמפוס יש מספר מאפיינים מגדירים ייחודיים, כולל הפלסטיות שלו והפוטנציאל לנוירוגנזה מתמשכת². נוירוגנזה היא תהליך ההתפשטות וההתמיינות של תאי גזע עצביים, ולאחר מכן השתלבותם ברשת העצבית הקיימת. נוירוגנזה מוגבלת לאזור התת-גרנולרי של הג’ירוס המשונן ולאזור התת-חדרי של החדרים הצדדיים (ונורות חוש הריח)³. בעוד שנוירוגנזה נפוצה באמבריוגנזה, זהו תהליך לכל החיים ^3,4. ככזה, דיון זה יתמקד בנוירוגנזה של מבוגרים בהיפוקמפוס.

האזורים התת-חדריים והתת-גרנולאריים הם נישות נוירוגניות המכילות תאים אפנדימליים וסקולריים, כמו גם שושלות לא בוגרות ובשלות של תאי גזע עצביים⁵. מיקרוגליה תורמת לנישות אלה כתאי מערכת החיסון לווסת את הנוירוגנזה⁶. תאי אב עצביים הם צאצאים של תאי גזע עצביים^שאינם תאי מערכתם של תאי גזע עצביים 7. שלושה סוגים של אבות עצביים נמצאים באזור התת-חדרי: תאים דמויי גליה רדיאליים מסוג B, אבות מגבירי מעבר מסוג C ונוירובלסטים מסוג A ^3,8. תאי האב העצביים מסוג B המתחלקים באיטיות באזור התת-חדרי יכולים להתמיין לתאים מסוג C המתחלקים במהירות⁸. לאחר מכן, תאים מסוג C מתמיינים לתאים מסוג A⁸. נוירובלסטים אלה נודדים דרך הזרם הנודד הרוסטרלי אל נורת חוש הריח לפני שהם מתמיינים לאינטרנאורונים או לאוליגודנדרוציטים⁹. פקעות חוש הריח האלה הן המפתח לזיכרון לטווח קצר של חוש הריח, וללמידה אסוציאטיבית, בעוד שהאוליגודנדרוציטים מיאלינטים אקסונים של קורפוס קלוסום⁹. רוב הנוירוגנזה הבוגרת מתרחשת באזור התת-גרנולרי של הפיתול המשונן, שם נמצאים אבות עצביים רדיאליים מסוג 1 ו-nonradial Type 2³. רוב תאי האב העצביים מיועדים להפוך לנוירונים גרגיריים משוננים ואסטרוציטים¹⁰. מחוברים על ידי צמתים מרווחים, אסטרוציטים יוצרים רשתות כדי לווסת את הפלסטיות, הפעילות הסינפטית וההתרגשות העצבית⁵. כנוירון המעורר העיקרי של הפיתול המשונן, תאי גרגירים מספקים קלט מקליפת המוח האנטורינלית לאזור CA3¹¹.

ניתן לבודד אוכלוסיות תאי גזע עצביים באמצעות אסטרטגיות בידוד אימונומגנטיות או אימונופלואורסצנטיות^12,13. רקמה עצבית קשה במיוחד לניתוק; מאמצים לעשות זאת גורמים לעתים קרובות לדגימות עם כדאיות תאית ירודה ו/או לא מצליחים לייצר את ההשעיה החד-תאית הדרושה לניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי, או שילוב של טכניקות^14,15. במחקר שהעריך שיטות דיסוציאציה עצבית, הכדאיות והאיכות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה פיפטה לעומת שילובים של טריטורציה פיפטה ועיכול עם אנזימים שונים הושוו¹⁵. האיכות דורגה על סמך כמות גושי התאים והדנ”א או הפסולת התת-תאית בתרחיף המוכן¹⁵. השעיות של גידולי גליה שהיו נתונים לדיסוציאציה מכנית ידנית בלבד היו בעלות יכולת נמוכה משמעותית של התאים בהשוואה לטיפולים עם דיספוזה או שילוב של DNase, collagenase ו-hyaluronidase¹⁵. Volovitz et al. הכירו בשונות הכדאיות והאיכות בין השיטות השונות והדגישו כי דיסוציאציה לא מספקת עלולה להפחית את הדיוק של ניתוח במורד הזרם¹⁵.

במחקר נפרד, המחברים השוו יותר מ-60 שיטות ושילובים שונים של דיסוציאציה של תאי עצב בתרבית¹⁴. שיטות אלה כללו שמונה וריאציות שונות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה של פיפטה, השוואה של דגירה עם חמישה אנזימים בודדים בשלושה מרווחי זמן שונים, ושילובים שונים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי או שילוב של שני אנזימים¹⁴. אף אחת מהשיטות המכניות לא הניבה השעיה חד-תאית¹⁴. ארבעה מהטיפולים באנזים יחיד, עשרה מהטיפולים האנזימטיים המשולבים וארבעה מהשילובים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי הניבו תרחיף חד-תאי¹⁴. עיכול אנזימטי עם TripLE ואחריו Tripsin-EDTA ביעילות היעילה ביותר ניתוק דגימות¹⁴. אגב, דגימות שטופלו ב-TrypLE ו/או ב-Trypsin-EDTA נטו ליצור גושים ג’לטיניים¹⁴. בעוד שמחקר זה בוצע על תאים בתרבית, הוא מדבר על החסרונות של טריטורציה פיפטה או עיכול אנזימטי בלבד.

חסרות השוואות זו לצד זו של דיסוציאציה מכנית ידנית לעומת אוטומציה. עם זאת, קבוצה אחת הפעילה ציטומטריית זרימה כדי להשוות דיסוציאציה מכנית ידנית ואוטומטית למחצה של מוחות עכברים שלמים בשילוב עם ערכות דיסוציאציה אנזימטיות מסחריות של פפאין או טריפסין¹⁶. עיבוד עם הדיסוציאטור הניב באופן עקבי יותר תאים בני קיימא¹⁶. בעקבות הדיסוציאציה, החוקרים בודדו גם תאי פרומינין-1, תאים מקדימים עצביים ומיקרוגליה¹⁶. עבור שתיים מתוך שלוש אוכלוסיות התאים המבודדים, טוהר התאים המבודדים היה מעט גבוה יותר כאשר הדגימות עובדו עם הדיסוציאטור, בהשוואה^ל-16 באופן ידני. Reiß et al. ציינו כי השתנות מאדם לאדם בטכניקת הצינורות מעכבת את יכולת השכפול של תפוקת אוכלוסיית התאים בת-קיימא בדיסוציאציה של רקמות¹⁶. החוקרים הגיעו למסקנה כי דיסוציאציה מכנית אוטומטית מתקננת עיבוד דגימות¹⁶.

שיטת הדיסוציאציה המתוארת בכתב יד זה היא שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית לחלוטין ועיכול אנזימטי, תוך שימוש בתמיסות המלוות בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר¹⁷. בניגוד לפרוטוקולים סטנדרטיים, פרוטוקול מותאם זה מפחית מניפולציה של דגימות, מניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר ומיועד לעיבוד כמויות מינימליות של רקמת התחלה.