概要

Un cultivo de explantes de cola 3-D para estudiar la segmentación de vertebrados en el pez cebra

Published: June 30, 2021
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概要

Aquí, presentamos el protocolo para el cultivo de tejidos 3-D del eje posterior del cuerpo del pez cebra, lo que permite el estudio en vivo de la segmentación de vertebrados. Este modelo de explant proporciona control sobre el alargamiento del eje, alteración de las fuentes de morfógenos y obtención de imágenes vivas a nivel de tejido de resolución subcelular.

Abstract

Los embriones de vertebrados modelan su eje corporal principal como somitas repetitivas, los precursores de las vértebras, los músculos y la piel. Las somitas se segmentan progresivamente desde el mesodermo presomático (PSM) a medida que el extremo de la cola del embrión se alarga posteriormente. Los somitas se forman con periodicidad regular y escala en tamaño. El pez cebra es un organismo modelo popular, ya que es genéticamente manejable y tiene embriones transparentes que permiten obtener imágenes vivas. Sin embargo, durante la somitogénesis, los embriones de peces se envuelven alrededor de una yema grande y redondeada. Esta geometría limita las imágenes vivas de tejido PSM en embriones de pez cebra, particularmente a resoluciones más altas que requieren una distancia de trabajo objetiva cercana. Aquí, presentamos un método aplanado de la cultura del tejido de 3-D para la proyección de imagen viva de los explantes de la cola del pez cebra. Los explantes de cola imitan los embriones intactos mostrando una desaceleración proporcional de la elongación del eje y el acortamiento de las longitudes de somita rostrocaudal. Además, somos capaces de detener la velocidad de elongación del eje a través del cultivo de explantes. Esto, por primera vez, nos permite desenredar la entrada química de los gradientes de señalización de la entrada mecanicista de la elongación axial. En estudios futuros, este método se puede combinar con una configuración microfluídica para permitir perturbaciones farmacéuticas controladas por el tiempo o la detección de la segmentación de vertebrados sin ningún problema de penetración de fármacos.

Introduction

La segmentación metamérica de organismos es ampliamente utilizada en la naturaleza. Las estructuras repetidas son esenciales para la funcionalidad de órganos laterales como vértebras, músculos, nervios, vasos, extremidades u hojas en un plan corporal1. Como resultado de tales restricciones fisiológicas y geométricas de la simetría axial, la mayoría de los filos de Bilateria-tales como anélidos, artrópodos, y cordados-exhiben la segmentación de sus tejidos embrionarios (e.g., ectodermo, mesodermo) antero-posteriorly.

Los embriones de vertebrados segmentan secuencialmente su mesodermo paraxial a lo largo del eje principal del cuerpo en somitas con intervalos específicos de la especie, recuentos y distribuciones de tamaño. A pesar de tal robustez entre embriones individuales dentro de una especie, la segmentación de somita es versátil entre las especies de vertebrados. La segmentación ocurre en un vasto régimen de intervalos de tiempo (de 25 min en el pez cebra a 5 h en humanos), tamaños (de ~20 μm en somitas de cola de pez cebra a ~200 μm en somites de tronco de ratones) y recuentos (de 32 en pez cebra a ~300 en serpientes de maíz)2. Más interesante aún, los embriones de peces pueden desarrollarse en un amplio rango de temperaturas (desde ~ 20.5 ° C hasta 34 ° C para el pez cebra) mientras mantienen sus somitas intactas con distribuciones de tamaño adecuadas al compensar tanto los intervalos de segmentación como las velocidades de elongación axial. Más allá de estas interesantes características, el pez cebra se mantiene como un organismo modelo útil para estudiar la segmentación en vertebrados debido al desarrollo externo, síncrono y transparente de una plenitud de embriones hermanos, así como sus herramientas genéticas accesibles. Negativamente desde una perspectiva de microscopía, los embriones de teleósteo se desarrollan en una yema esférica voluminosa, estirando y redondeando el tejido gastrulante a su alrededor (Figura 1A). En este artículo, presentamos un cultivo de explantes de tejido 3-D aplanado para colas de pez cebra. Este sistema de explantes evita las restricciones esféricas de la masa de yema, lo que permite el acceso a imágenes vivas de alta resolución de embriones de peces para el modelado de somita.

Figure 1
Figura 1:Sistema de explante de cámara deslizante para embriones de pez cebra. (A) Los embriones de pez cebra tienen ventajas para la obtención de imágenes vivas, como la transparencia del tejido embrionario gastrulado (azul), pero el tejido se forma alrededor de una masa de yema esférica voluminosa (amarillo) que impide obtener imágenes casi objetivas y de alta resolución en embriones intactos. Los explantes de cola se pueden diseccionar comenzando con un cuchillo microquirúrgico (marrón) cortado del tejido anterior de somitas (rojo) y continuando en el borde con la yema posterior. (B) Los explantes de cola disecados pueden colocarse en un cubrebocas (azul claro) dorsoventralmente; mantener el tejido neural (gris claro) en la parte superior y la notocorda (gris oscuro) en la parte inferior. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Protocol

Este protocolo implica el uso de embriones de vertebrados vivos menores de 1 día después de la fertilización. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las pautas éticas del Cincinnati Children’s Hospital Medical Center; los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo # 2017-0048). 1. Recolección de embriones Configure pares de peces cebra en tanques de cruce la noche antes del día de reco…

Representative Results

Este protocolo permite el cultivo geométrico plano de explantes de cola de pez cebra vivos. El cultivo de tejidos presenta tres ventajas principales sobre embriones enteros: 1) control de la velocidad de elongación del eje, 2) control sobre varias fuentes de señalización (morfógeno) por disección simple, y 3) cerca de objetivos, alta ampliación y altas imágenes en vivo de NA. Las cámaras deslizantes no tratadas químicamente permiten que el explante de la cola alargue su eje principal…

Discussion

Este artículo presenta un protocolo detallado de una técnica del explant de la cultura del tejido que desarrollamos y utilizamos recientemente5 para los embriones del pez cebra. Nuestra técnica se basa en los métodos de explantación anteriores en el polluelo8 y el pez cebra9,10,11 organismos modelo. Los explantes de cola preparados con este protocolo pueden sobrevivir hasta >1…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la AECOM Zebrafish Core Facility y Cincinnati Children’s Veterinary Services por el mantenimiento de peces, al Cincinnati Children’s Imaging Core por la asistencia técnica, a Didar Saparov por la asistencia con la producción de video y a Hannah Seawall por editar el manuscrito. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R35GM140805 a E.M.Ö. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Co. REF 309597 for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous Decon Labs 2701 for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955 for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder Sigma-Aldrich 499609 for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D5879 for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel Integra-Miltex MIL4-411 for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich 886-86-2 (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher A3160601 additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 Invitrogen Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red GIBCO 21083-027 for tissue dissection media
Methanol Sigma-Aldrich 179337 for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade Surgical Specialties 72-2863 for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK Sigma-Aldrich Cat#M8159; RRID:AB_477245 for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent Invitrogen R37106 (optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich 158127 for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution Sigma-Aldrich 122-20 (optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator Tokai Hit tokai-hit-stxg (optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4'' Scotch S-9782 for preparing tape slide wells
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 for immunostaining
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) Campbell et al., 2015 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) Cooper et al., 2005 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 transgenic fish with cell membrane localized EGFP

参考文献

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  2. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
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記事を引用
Simsek, M. F., Özbudak, E. M. A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (172), e61981, doi:10.3791/61981 (2021).

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