概要

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養

Published: June 30, 2021
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概要

ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。

Abstract

脊椎動物の胚は、脊椎、筋肉、および皮膚の前駆体である反復性スマイトとして主体軸をパターン化する。節内皮(PSM)から徐々に胚の尾端が後方に伸びる。スミテは、周期性とサイズの尺度を持つ形をする。ゼブラフィッシュは、遺伝的に難解であり、生きたイメージングを可能にする透明な胚を有するため、人気のあるモデル生物です。それにもかかわらず、ソミト生成の間に、魚の胚は大きな丸い黄身に包まれる。この幾何学は、特に近い目的の作業距離を必要とするより高い解像度で、ゼブラフィッシュ胚におけるPSM組織の生画像を制限する。ここでは、ゼブラフィッシュの尾葉の生画像化のための平坦化された3次元組織培養法を提示する。尾部外植は、軸伸びの比例減速とロストロコーダルスマイト長さの短縮を表示することによって、無傷の胚を模倣する。さらに、外植培養を通じて軸伸び速度を失速させることができる。これにより、信号勾配の化学入力を軸伸長の機械化入力から解き放つ。今後の研究では、この方法をマイクロ流体セットアップと組み合わせて、薬物侵入の懸念なしに、時間制御された医薬品摂動または脊椎動物セグメンテーションのスクリーニングを可能にすることができる。

Introduction

生物のメタメリックセグメンテーションは、自然界で広く使用されています。反復構造は、椎骨、筋肉、神経、血管、手足、またはボディプラン1の葉のような側面器官の機能性に不可欠である。このような軸対称性の生理学的および幾何学的制約の結果として、アネリド、節足動物、およびそれらの胚組織(例えば、外胚、メソダーム)の後方のセグメンテーションのようなビラテリアの大部分のフィラテリアの系統。

脊椎動物胚は、主体軸に沿ってパラキシャル中胚を、種固有の間隔、カウント、およびサイズ分布を持つスマイトに順番にセグメント化します。種内の個々の胚の間でこのような堅牢性にもかかわらず、脊椎動物種の間ではスマイトセグメンテーションが汎用性が高い。セグメンテーションは、時間間隔の広大な管理(ゼブラフィッシュの25分からヒトでは5時間まで)、サイズ(ゼブラフィッシュの尾節からマウスの幹スマイトで〜200μmまで)およびカウント(ゼブラフィッシュの32からトウモロコシヘビの〜300まで)2で起こる。さらに興味深いことに、魚の胚は、セグメンテーション間隔と軸伸び速度の両方を補うことによって、適切なサイズの分布でスマイトをそのまま維持しながら、幅広い温度(ゼブラフィッシュでは約20.5°Cから34°Cまで)で発達することができます。このような興味深い特徴を超えて、ゼブラフィッシュは、兄弟胚の豊かさの外部、同期的、透明な発達だけでなく、そのアクセス可能な遺伝的ツールのために脊椎動物のセグメンテーションを研究するのに有用なモデル生物として残ります。顕微鏡の観点から悪いことに、テレオスト胚はかさばる球状の黄身上で発達し、その周りの胃組織を伸ばし丸める(図1A)。本稿では、ゼブラフィッシュの尾に対する平坦化された3次元組織外植培養を紹介する。この外植体系は、黄身質量の球面制約を回避し、スマイトパターニングのための魚の胚の高解像度のライブイメージングへのアクセスを可能にする。

Figure 1
1:ゼブラフィッシュ胚用スライドチャンバー外植システム(A)ゼブラフィッシュ胚は、胚組織(青)の透明化などの生画像化に有利であるが、組織は、無傷の胚におけるほぼ客観的で高解像度のイメージングを防ぐ、かさばる球状黄身塊(黄色)の周りに形成される。尾部の外植は、スマイトの組織前部(赤)から切り取られ、後部の黄身との境界で続くマイクロサージカルナイフ(茶色)で解剖することができる。(B)解剖された尾の外植はカバースリップ(水色)のドーソベントラリーに置くことができる。神経組織(明るい灰色)を上に、脊索(濃い灰色)を底に保ちます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

このプロトコルは、1日より若い脊椎動物胚の使用を含む受精後1日未満。すべての動物実験はシンシナティ小児病院医療センターの倫理ガイドラインの下で行われました。動物の議定書は、制度的動物の世話と使用委員会によって見直され、承認された(プロトコル#2017-0048)。 1. 胚コレクション 胚採取の日の前夜に交差タンクにゼブラフィッシュのペアを設定しま?…

Representative Results

このプロトコルは生きているゼブラフィッシュ尾の外植の平らな幾何学的培養を可能にする。組織培養は、全胚に対して3つの大きな利点を提示する:1)軸伸長速度の制御、2)単純解剖による様々なシグナル伝達(モルフォゲン)源の制御、および3)ほぼ客観的で高い拡大および高NAライブイメージング。 化学的に未処理のスライドチャンバーは、尾部外植が下の組織の周りに?…

Discussion

この記事では、ゼブラフィッシュ胚のために最近開発し、使用した組織培養外植技術の詳細なプロトコルを提示します。私たちの技術は、ひよこ8とゼブラフィッシュ9、10、11モデル生物の以前の外植方法に基づいています。このプロトコルで調製された尾の外植は、単純なスライドチャ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、魚のメンテナンスのためのAECOMゼブラフィッシュコア施設とシンシナティ子供獣医サービス、技術的支援のためのシンシナティ子供イメージングコア、ビデオ制作の支援のためのディダルサパロフと原稿を編集するためのハンナシーウォールに感謝します。この出版物で報告された研究は、E.M.Öに賞番号R35GM140805の下で国立衛生研究所の国立一般医学研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Co. REF 309597 for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous Decon Labs 2701 for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955 for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder Sigma-Aldrich 499609 for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D5879 for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel Integra-Miltex MIL4-411 for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich 886-86-2 (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher A3160601 additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 Invitrogen Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red GIBCO 21083-027 for tissue dissection media
Methanol Sigma-Aldrich 179337 for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade Surgical Specialties 72-2863 for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK Sigma-Aldrich Cat#M8159; RRID:AB_477245 for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent Invitrogen R37106 (optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich 158127 for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution Sigma-Aldrich 122-20 (optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator Tokai Hit tokai-hit-stxg (optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4'' Scotch S-9782 for preparing tape slide wells
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 for immunostaining
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) Campbell et al., 2015 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) Cooper et al., 2005 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 transgenic fish with cell membrane localized EGFP

参考文献

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記事を引用
Simsek, M. F., Özbudak, E. M. A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (172), e61981, doi:10.3791/61981 (2021).

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