概要

ثقافة Explant الذيل ثلاثي الأبعاد لدراسة تجزئة الفقاريات في حمار وحشي

Published: June 30, 2021
doi:

概要

هنا، نقدم بروتوكول زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد لمحور الجسم الخلفي لسمك الحمار الوحشي، مما يتيح الدراسة الحية للتجزئة الفقارية. يوفر هذا النموذج explant السيطرة على استطالة المحور، وتغيير مصادر مورفوجين، والتصوير الحي على مستوى الأنسجة دون الخلوية.

Abstract

الأجنة الفقارية نمط محور الجسم الرئيسي كما السخام المتكررة، والسلائف من الفقرات والعضلات والجلد. Somites الجزء تدريجيا من mesoderm presomitic (PSM) كما نهاية ذيل الجنين elongates الخلفي. سوميتس شكل مع دورية منتظمة وحجم في الحجم. حمار وحشي هو كائن نموذجي شعبية كما هو قابل للسحب وراثيا والأجنة الشفافة التي تسمح للتصوير الحي. ومع ذلك ، خلال تكوين السميتوجين ، يتم لف أجنة الأسماك حول صفار كبير مستدير. تحد هذه الهندسة من التصوير الحي لأنسجة PSM في أجنة سمك الحمار الوحشي ، خاصة في القرارات الأعلى التي تتطلب مسافة عمل موضوعية وثيقة. هنا ، نقدم طريقة زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد المسطحة للتصوير الحي لمخلفات ذيل الحمار الوحشي. تحاكي النباتات الخلفية الأجنة السليمة من خلال عرض تباطؤ نسبي في استطالة المحور وتقصير أطوال السوسميت الوردية. نحن قادرون على المماطلة سرعة استطالة محور من خلال ثقافة explant. وهذا، للمرة الأولى، يمكننا من فك المدخلات الكيميائية لتدرجات الإشارات من الإدخال الآلي للاستطالة المحورية. في الدراسات المستقبلية ، يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع إعداد microfluidic للسماح بالاضطرابات الصيدلانية التي يتم التحكم فيها زمنيا أو فحص تجزئة الفقاريات دون أي مخاوف من اختراق الأدوية.

Introduction

يستخدم التقسيم الميتاميري للكائنات الحية على نطاق واسع في الطبيعة. الهياكل المتكررة ضرورية لوظائف الأعضاء الجانبية مثل الفقرات والعضلات والأعصاب والأوعية والأطراف أو الأوراق في خطة الجسم1. نتيجة لمثل هذه القيود الفسيولوجية والهندسية للتماثل المحوري ، فإن معظم فيلا بيلاتيريا – مثل الأنليدس والمفصليات وتجزئة عرض chordates من أنسجة الجنين (على سبيل المثال ، ectoderm ، mesoderm) antero-posteriorly.

تجزئ الأجنة الفقارية بشكل متسلسل مؤشر منتصف العمر المحوري على طول محور الجسم الرئيسي إلى زحمات مع فترات محددة للأنواع والأعداد وتوزيعات الحجم. على الرغم من هذه المتانة بين الأجنة الفردية داخل الأنواع ، فإن تجزئة السوسميت متعددة الاستخدامات بين الأنواع الفقارية. يحدث التقسيم في نظام واسع من الفواصل الزمنية (من 25 دقيقة في حمار وحشي إلى 5 ساعة في البشر) ، والأحجام (من ~ 20 ميكرومتر في ذيل somites من حمار وحشي إلى ~ 200 ميكرومتر في سومتس الجذع من الفئران) والتعول (من 32 في حمار وحشي إلى ~ 300 في ثعابين الذرة)2. والأكثر إثارة للاهتمام أن أجنة الأسماك يمكن أن تتطور في مجموعة واسعة من درجات الحرارة (من ~20.5 درجة مئوية إلى 34 درجة مئوية لسمك الحمار الوحشي) مع الحفاظ على السخامات سليمة مع توزيعات الحجم المناسبة من خلال التعويض عن كل من فترات التقسيم وسرعات الاستطالة المحورية. وإلى جانب هذه السمات المثيرة للاهتمام، يبقى سمك الحمار الوحشي ككائن حي نموذجي مفيد لدراسة التقسيم في الفقاريات بسبب التطور الخارجي المتزامن والشفاف لكثرة الأجنة الشقيقة وكذلك أدواتها الوراثية التي يمكن الوصول إليها. من منظور المجهر ، تتطور أجنة teleost على صفار كروي ضخم ، وتمتد وتتقريب الأنسجة الغازية حوله(الشكل 1A). في هذه المقالة، نقدم ثقافة explant الأنسجة ثلاثية الأبعاد بالارض لذيول حمار وحشي. هذا النظام explant يتحايل على القيود الكروية من كتلة صفار، مما يسمح بالوصول إلى التصوير الحي عالية الدقة من أجنة الأسماك لأنماط السوسميت.

Figure 1
الشكل 1:نظام Explant غرفة الشريحة لأجنة حمار وحشي. (أ) أجنة حمار وحشي لها مزايا للتصوير الحي، مثل شفافية الأنسجة الجنينية الغازية (الأزرق)، ولكن الأنسجة تتشكل حول كتلة صفار كروية ضخمة (صفراء) تمنع التصوير شبه الموضوعي وعالي الدقة في الأجنة السليمة. يمكن تشريح النباتات السابقة الذيل بدءا من سكين المجهرية (البني) قطع من الأنسجة الأمامية من السخام (الأحمر) والاستمرار على الحدود مع صفار الخلفي. (ب)يمكن وضع البهلوات الذيل تشريح على غطاء (الأزرق الفاتح) dorsoventrally; الحفاظ على الأنسجة العصبية (رمادي فاتح) على أعلى وnochord (رمادي داكن) في الجزء السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

يتضمن هذا البروتوكول استخدام الأجنة الفقارية الحية التي تقل فترة ما بعد الإخصاب بيوم واحد. وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية للمركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال؛ تمت مراجعة البروتوكولات الحيوانية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية ال…

Representative Results

هذا البروتوكول يتيح زراعة هندسية مسطحة من النباتات الحية ذيل حمار وحشي. تقدم زراعة الأنسجة ثلاث مزايا رئيسية على الأجنة الكاملة: 1) التحكم في سرعة استطالة المحور ، 2) التحكم في مصادر الإشارات المختلفة (مورفوجين) عن طريق تشريح بسيط ، و 3) شبه موضوعية ، والتكبير العالي والتصوير الحي NA عالية. <p…

Discussion

تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتقنية زراعة الأنسجة التي طورناها واستخدمناها مؤخرا5 لأجنة حمار وحشي. تقنيتنا يبني على أساليب explant السابقة في الفرخ8 وسمك الحمار الوحشي9،10،11 نموذج الكائنات الحية. يمكن explants الذي?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر مرفق AECOM Zebrafish Core والخدمات البيطرية للأطفال في سينسيناتي على صيانة الأسماك ، وجوهر تصوير الأطفال في سينسيناتي للمساعدة التقنية ، وديدار ساباروف للمساعدة في إنتاج الفيديو وهانا سيوال لتحرير المخطوطة. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم R35GM140805 إلى E.M.Ö. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Co. REF 309597 for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous Decon Labs 2701 for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955 for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder Sigma-Aldrich 499609 for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich D5879 for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel Integra-Miltex MIL4-411 for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich 886-86-2 (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher A3160601 additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 Invitrogen Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red GIBCO 21083-027 for tissue dissection media
Methanol Sigma-Aldrich 179337 for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade Surgical Specialties 72-2863 for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK Sigma-Aldrich Cat#M8159; RRID:AB_477245 for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent Invitrogen R37106 (optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich 158127 for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution Sigma-Aldrich 122-20 (optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator Tokai Hit tokai-hit-stxg (optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4'' Scotch S-9782 for preparing tape slide wells
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 for immunostaining
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) Campbell et al., 2015 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) Cooper et al., 2005 ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 transgenic fish with cell membrane localized EGFP

参考文献

  1. Assheton, R. . Growth in length: Embryological Essays. , (1916).
  2. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
  3. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).
  4. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
  5. Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
  6. Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
  7. Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
  8. Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. 発生生物学. 167 (1), 87-103 (1995).
  9. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
  10. Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).
  11. Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. 発生生物学. 406 (2), 172-185 (2015).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).

Play Video

記事を引用
Simsek, M. F., Özbudak, E. M. A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (172), e61981, doi:10.3791/61981 (2021).

View Video