概要

Imaging di calcio in vivo di successo con un microscopio miniaturizzato head-mount nell'amigdala del topo che si comporta liberamente

Published: August 26, 2020
doi:

概要

L’imaging microendoscopico in vivo del calcio è uno strumento inestimabile che consente il monitoraggio in tempo reale delle attività neuronali negli animali che si comportano liberamente. Tuttavia, l’applicazione di questa tecnica all’amigdala è stata difficile. Questo protocollo mira a fornire una linea guida utile per indirizzare con successo le cellule di amigdala con un microscopio miniaturizzato nei topi.

Abstract

Il monitoraggio in tempo reale in vivo delle attività neuronali negli animali che si muovono liberamente è uno degli approcci chiave per collegare l’attività neuronale al comportamento. A tal fine, è stata sviluppata e applicata con successo a molte strutture cerebrali1,2,3,4,5,6una tecnica di imaging in vivo che rileva i transitori di calcio nei neuroni utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), un microscopio a fluorescenza miniaturizzata e una lente indice di rifrazione gradiente (GRIN). Questa tecnica di imaging è particolarmente potente perché consente l’imaging simultaneo cronico di popolazioni cellulari geneticamente definite per un periodo di lungo periodo fino a diverse settimane. Sebbene utile, questa tecnica di imaging non è stata facilmente applicata alle strutture cerebrali che si trovano in profondità nel cervello come l’amigdala, una struttura cerebrale essenziale per l’elaborazione emotiva e la memoria della pauraassociativa 7. Ci sono diversi fattori che rendono difficile l’applicazione della tecnica di imaging all’amigdala. Ad esempio, gli artefatti del movimento di solito si verificano più frequentemente durante l’imaging condotto nelle regioni cerebrali più profonde perché un microscopio a testa impiantato in profondità nel cervello è relativamente instabile. Un altro problema è che il ventricolo laterale è posizionato vicino alla lente GRIN impiantata e il suo movimento durante la respirazione può causare artefatti di movimento altamente irregolari che non possono essere facilmente corretti, il che rende difficile formare una vista di imaging stabile. Inoltre, poiché le cellule nell’amigdala sono solitamente silenziose in uno stato di riposo o anestetizzato, è difficile trovare e mettere a fuoco le cellule bersaglio che esprimono GECI nell’amigdala durante la procedura di base per l’imaging successivo. Questo protocollo fornisce una linea guida utile su come indirizzare in modo efficiente le cellule che esprimono GECI nell’amigdala con microscopio miniaturizzato a testa per un’imaging di calcio in vivo di successo in una regione cerebrale così profonda. Si noti che questo protocollo si basa su un particolare sistema (ad esempio, Inscopix) ma non limitato ad esso.

Introduction

Il calcio è un secondo messaggero onnipresente, che gioca un ruolo cruciale in quasi tutte le funzioni cellulari8. Nei neuroni, il potenziale d’azione di cottura e l’input sinaptico causano un rapido cambiamento del libero intracellulare [Ca2+]9,10. Pertanto, tracciare i transitori di calcio offre l’opportunità di monitorare l’attività neuronale. I GECI sono potenti strumenti che consentono il monitoraggio [Ca2+] in popolazioni cellulari definite e compartimenti intracellulari11,12. Tra molti tipi diversi di indicatore di calcio a base proteica, GCaMP, una sonda Ca2+ basata su una singola molecola GFP13, è il GECI più ottimizzato e quindi ampiamente utilizzato. Attraverso più cicli di ingegneria, è stato sviluppato un certo numero di varianti di GCaMP12,14,15,16. Usiamo uno dei GCAMP sviluppati di recente, GCaMP7b, in questo protocollo16. I sensori GCaMP hanno notevolmente contribuito allo studio delle funzioni del circuito neurale in una serie di organismi modello come l’imaging dei transitori Ca2+ durante losviluppo 17,l’imaging in vivo in uno specifico strato corticale18,la misurazione della dinamica del circuito nell’apprendimento delle attività motorie19 e l’imaging dell’attività dell’insieme cellulare correlata alla memoria della paura associativa nell’ippocampo e nell’amigdala20,21.

L’imaging ottico dei GECI presenta diversivantaggi 22. La codifica genetica consente ai GECI di essere espressi stabilmente per un periodo di tempo a lungo termine in un sottoinsieme specifico di cellule definite dal profilo genetico o da modelli specifici di connettività anatomica. L’imaging ottico consente il monitoraggio cronico simultaneo in vivo di centinaia o migliaia di neuroni negli animali vivi. Sono stati sviluppati alcuni sistemi di imaging ottico per l’imaging in vivo e l’analisi di GECI all’interno del cervello di topi che si comportano liberamente con microscopi miniaturizzati a fluorescenzaa testa 21,23,24,25. Nonostante la tecnica di imaging ottico in vivo basata su GECI, lente GRIN e un microscopio in miniatura a testa sia un potente strumento per studiare il legame tra attività e comportamento del circuito neurale, l’applicazione di questa tecnologia all’amigdala è stata difficile a causa di diversi problemi tecnici legati al targeting dell’obiettivo GRIN alle cellule che esprimono GECI nell’amigdala senza causare artefatti di movimento che riducono gravemente la qualità dell’acquisizione di immagini e trovano cellule che esprimono GECI. Questo protocollo mira a fornire una linea guida utile per le procedure chirurgiche di attacco della piastra di base e impianto dell’obiettivo GRIN che sono passaggi critici per l’imaging ottico di calcio in vivo di successo nell’amigdala. Sebbene questo protocollo si rivolge all’amigdala, la maggior parte delle procedure descritte qui sono comunemente applicabili ad altre regioni cerebrali più profonde. Sebbene questo protocollo sia basato su un particolare sistema (ad esempio, Inscopix), lo stesso scopo può essere facilmente raggiunto con altri sistemi alternativi.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato etico animale del Korea Advanced Institute of Science and Technology. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali. NOTA: Questo protocollo consiste in sei passaggi principali: chirurgia dell’iniezione di virus, chirurgia implantare dell’obiettivo GRIN, convalida dell’impianto dell’obiettivo GRIN, attacco della base, registrazione ottica del segnale GCaMP durant…

Representative Results

Convalida dell’impianto dell’obiettivo GRINPrima di attaccare cronicamente la base al cervello cementando, l’impianto dell’obiettivo GRIN deve essere convalidato. Negli animali con impianto di lenti di successo, sia GCaMP che esprimono cellule e vasi sanguigni sono stati chiaramente osservati all’interno di un intervallo piana focale determinato dalla distanza tra lente oggettiva del microscopio e lente GRIN impiantata (Figura 2A e B). …

Discussion

Le abili tecniche chirurgiche sono essenziali per ottenere un’imaging ottico di calcio in vivo di successo con microscopia miniaturica a testa in regioni cerebrali più profonde come l’amigdala come abbiamo descritto qui. Pertanto, sebbene questo protocollo fornisca una linea guida per processi chirurgici ottimizzati di attacco della piastra di base e impianto dell’obiettivo GRIN, potrebbero essere necessari ulteriori processi di ottimizzazione per i passaggi critici. Come accennato nella sezione del protocollo, le coord…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).

Materials

26G needle BD 302002 Surgery
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE Addgene 104493-AAV1 Surgery
AAV2/1-CaMKiiα-GFP custom made Surgery
Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) Lang 1334-pink Surgery & Baseplate Attachment
Air flow manipulator Neurotar NTR000253-04 Baseplate Attachment
Amoxicillin SIGMA A8523-5G Surgery
Baseplate INSCOPIX 1050-002192 Baseplate Attachment
Baseplate cover INSCOPIX 1050-002193 Baseplate Attachment
Behavioral apparatus (chamber) Coulbourn Instrument Testcage Behavior test
Behavioral apparatus (software) Coulbourn Instrument Freeze Frame Behavior test
Carbon cage Neurotar 180mm x 70mm Baseplate Attachment
Carprofen SIGMA PHR1452-1G Surgery
Data processing software INSCOPIX INSCOPIX Data Processing Software Baseplate Attachment & Behavior test
Dexamethasone SIGMA D1756-500MG Surgery
Drill Seyang marathon-4 Surgery
Drill bur ELA US1/2, Shank104 Surgery
Glass needle WPI PG10165-4 Surgery
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) INSCOPIX 1050-002208 Surgery
Hamilton Syringe Hamilton 84875 Surgery
Head plate Neurotar Model 5 Surgery
Hex-key INSCOPIX 1050-004195 Baseplate Attachment
Laptop computer Samsung NT950XBV Surgery & Baseplate Attachment
Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) INSCOPIX 1050-004223 Surgery
Microscope gripper INSCOPIX 1050-002199 Baseplate Attachment
Microscope, DAQ software, hardware INSCOPIX nVista 3.0 Baseplate Attachment & Behavior test
Mobile homecage Neurotar MHC V5 Baseplate Attachment
Moterized arm Neurostar Customized Surgery
Moterized arm software Neurostar Customized Surgery
NI board National instrument Behavior test
Removable epoxy bond WPI Kwik-Cast Surgery
Resin cement (Super-bond) Sun medical Super bond C&B Surgery
Skull screw Stoelting 51457 Surgery
Stereotaxic electrode holder ASI EH-600 Surgery
Stereotaxic frame Stoelting 51600 Surgery
Stereotaxic manipulator Stoelting 51600 Baseplate Attachment

参考文献

  1. Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
  2. Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
  3. Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
  4. Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
  5. Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
  6. Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
  7. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
  8. Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
  9. Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
  10. Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
  11. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  12. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  17. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  18. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  19. Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
  20. Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
  21. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  22. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  23. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  24. Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  25. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  26. Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
  27. Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
  28. Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. 神経科学. 10 (4), 1269-1300 (1983).
  29. McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
  30. McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).

Play Video

記事を引用
Lee, H., Han, J. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (162), e61659, doi:10.3791/61659 (2020).

View Video